在实验性自身免疫性神经炎大鼠模型外周神经过表达微小RNA-338的疗效观察及机理探讨

发布时间：2018-02-24 06:13

本文关键词： 自身免疫性神经炎微小RNA-338 外周神经超微结构蛋白表达　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、实验性自身免疫性神经炎大鼠模型(一)研究目的：深入研究格林巴利综合征动物模型,分别从模型大鼠的临床表现、体重、神经肌肉功能、外周神经组织形态学,包括超微结构、光镜形态、免疫荧光化学,以及外周神经电生理和腓肠肌光镜形态等几个方面综合评价格林巴利综合征大鼠模型的疾病进展情况；并在此基础上进一步研究了炎性因子Iba1在大鼠模型坐骨神经中的表达及定位情况,那就力图建立更全面的大鼠格林巴利综合征模型疾病进展评价指标,为利用该模型进行格林巴利综合征治疗方法及相关机制的研究提供新的研发思路和评价指标。(二)研究方法：本研究模型动物选取Lewis雌性大鼠20只,将其随机分为实验组10只与对照组10只。实验组采用P0180-199多肽、不完全弗氏佐剂(IFA)和结核菌素(H37Ra)混合制剂通过大鼠双足垫进行免疫,对照组将0.9%生理盐水等量相同方法足垫注射。免疫后连续观察症状、体重,进行临床神经肌肉功能评分,两组于疾病高峰期即免疫后第18天(据临床评分曲线得出)在体检测坐骨神经电生理、取材进行电镜及免疫荧光化学、光镜下腓肠肌HE染色及运动终板乙酰胆碱酯酶的检测,其中重点研究坐骨神经超微结构及免疫荧光化学指标,免疫荧光化学指标选取CD3(T细胞),Iba-1(巨噬细胞),S100(髓鞘),neurofilament 200 (轴突)。(三)研究结果：1.模型大鼠诱导后第1天开始出现症状,第7天时所有大鼠均出现尾巴下垂,提示造模成功,17-18天达疾病高峰,约42天疾病恢复到稳定状态；2.EAN组大鼠发病过程中第7,14,21,28,35,42天,体重(单位：g)分别为：160±2.07,173.3±16.8,190.5±14.6,198.6±6.7,207.3±6.9,216.8±8.9,较对照组体重(169.2±0.57,178.5±9.6,202±±10.6,210.5±13.7,216±5.6,223.9±4.6)明显降低,并有统计学意义(P0.05)；3.疾病高峰期,EAN组坐骨神经传导速度(19.69+4.47)m/s,明显低于对照组(30.98±2.71)m/s(P0.0001)；EAN组坐骨神经复合动作电位振幅(峰-峰值)(2.12±0.83)mV,明显低于对照组(12.18±1.71)mV(P0.0001)；4.疾病高峰期,EAN组坐骨神经髓鞘结构表现为3种病理改变：水肿、空洞形成、髓鞘脱失,伴随轴突变细或消失；腓肠肌纤维变细、胞浆淡染,运动终板乙酰胆碱酯酶数量减少、颜色变浅；5.坐骨神经髓鞘结构以水肿、脱失为主者免疫组织化学指标Iba-1 (microglia)、CD3(Tcells)增多明显,坐骨神经髓鞘结构以空洞形成、脱失为主者神经髓鞘蛋白S100明显减少,坐骨神经髓鞘结构以脱失为主者神经轴蛋白neurofilament200减少。实验过程中发现Iba-I与S100在髓鞘上共染,提示血旺细胞在疾病的进程中可能起到类似巨噬细胞的作用。(四)研究意义：本实验EAN发病过程及高峰期的各项评价指标为该模型进-步的病生理过程探讨提供了依据。发现Iba-I与S100在髓鞘上共染,提示血旺细胞在疾病的进程中可能起到类似巨噬细胞的作用,这对该模型是一个有用的补充,为GBS的治疗提供了新的视角。同时模型的成功建立和研究,为本课题微小RNA的治疗奠定了动物模型的基础。二、携带微小RNA-338 (miR-338-LV)的慢病毒对自身免疫性神经炎(EAN)大鼠模型的干预研究(一)研究目的：miR-338-LV对促进EAN模型大鼠坐骨神经运动功能恢复的研究。(二)研究方法：1.构建慢病毒携带的促进雪旺细胞髓鞘化的miRNA-338,即miR-338-LV病毒液；2.实验分组：Lewis雌性大鼠60只随机分为治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)、模型组、正常对照组各15只。前三组用P0180-199、H37Ra、生理盐水、IFA混合液200ul二等分等量注射入雌性Lewis大鼠双足垫制备EAN动物模型(见第二章),正常对照组足垫注射相同剂量的生理盐水。3.药物干预：治疗组于免疫后出现神经系统症状(即尾巴下垂,评分1分)时于坐骨神经局部多点注射miR-338-LV,1次,每个部位约25ul,6个部位,总量150ul；阳性药物组于免疫后出现神经系统症状(即尾巴下垂,评分1分)时通过大鼠尾静脉按照100mg/100g体重注射丙种球蛋白(IVIg),1次/天,连续2天。4.指标观察：治疗组、阳性药物组、模型组及正常对照组分别在免疫后疾病高峰期及免疫后42天采用生物机能实验系统检测大鼠坐骨神经运动传导速度及复合肌肉动作电位振幅,取材进行坐骨神经电镜、腓肠肌光镜、坐骨神经S100、Iba-1(microglia)、neurofilament200等蛋白的免疫荧光化学指标等的变化,实验中连续观察大鼠行为学变化和体重,并评分。(三)研究结果：1.治疗组(miR-338组)及阳性药物组(IVIg组)疾病高峰出现时间分别为第21天和第22天,较模型组第18天延迟；治疗组(miR-338组)及阳性药物组(IVIg组)在疾病高峰期的临床神经肌肉评分分值分别为(3.5±0.4)分和(2.75±0.25)分,较模型组(3.92±0.2)显著降低(P0.05),治疗组(miR-338组)及阳性药物组(IVIg组)之间有显著性差异(P0.05)；治疗组(miR-338组)及阳性药物组(IVIg组)在疾病恢复期的临床神经肌肉评分分值较模型组(2.0±0.32)显著降低(P0.05),治疗组(miR-338组)及阳性药物组(IVIg组)的临床神经肌肉评分分值分别为1.2±0.12,1.0±0.24,二者之间无显著性差异(P0.05)。治疗组从治疗到恢复时间30天,较阳性药物组36天明显缩短。2.治疗组(miR-338组)较阳性药物组(IVIg组)在疾病高峰期的神经传导速度显著提高,治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)的传导速度分别为(28.41±0.7)m/s和(25.4±20.98)m/s,二者之间有显著性差异(P0.01)。治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)及模型组在疾病高峰期和恢复期的神经传导速度均较正常对照组低。治疗组(miR-338组)和阳性药物组(IVIg组)疾病高峰期的传导速度较模型组(19.69±4.47m/s)显著提高。治疗组(miR-338组)与阳性药物组(IVIg组)在疾病恢复期的神经传导速度相同,无显著性差异。3.治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)在疾病高峰期的复合动作电位波幅较模型组(2.12±0.83mV)显著提高,治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)的复合动作电位波幅分别为(6.47+0.12)mV和(6.03±0.1)mV,二者之间无显著性差异。治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)及模型组(EAN组)在疾病高峰期和恢复期的复合动作电位波幅均较正常对照组低。治疗组(miR-338组)与阳性药物组(IVIg组)在疾病恢复期的复合动作电位波幅相同,无显著性差异。4.光镜腓肠肌检测结果发现疾病高峰期,治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)及模型组(EAN组)大鼠腓肠肌均表现为不同程度的细胞膜完整性破坏,细胞质染色不均匀、颜色变浅,细胞核偏离边缘,或消失,肌纤维杂乱、变细,之间空隙增大。治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)的病变程度轻于模型组。疾病恢复期,各组大鼠腓肠肌结构明显改善,细胞膜完整性增强,细胞质染色均匀,细胞核位于细胞边缘,肌纤维间空隙变小。5.透射电镜观察坐骨神经发现,治疗组(miR-338组)、阳性药物组(IVIg组)及模型组(EAN组)坐骨神经均有三种病理表现,髓鞘剥脱、髓鞘空洞形成及髓鞘肿胀。高峰期,干预组均比模型对照组显示出较轻的病变,剥脱及空洞处可见组织增生及细胞修复的组织结构,肿胀程度较轻。治疗组(miR-338组)髓鞘数目明显增多,髓鞘肿胀数目在阳性药物组(IVIg组)中明显减少。恢复期,治疗组(miR-338组)与阳性药物组(IVIg组)相同,无显著性差异。6.免疫荧光检测结果发现,治疗组(miR-338组)较阳性药物组(IVIg组)高峰期S100表达显著增高；与EAN组相比,治疗组(miR-338组)和阳性药物组(IVIg组)治疗后高峰期Iba1表达显著减少,S100、NF200表达显著增多。恢复期,治疗组与阳性药物组无明显差异。(四)研究意义：以慢病毒为载体的miRNA-338局部注射入坐骨神经后的过表达作用能改善EAN发病过程中神经肌肉功能,延长高峰期出现时间,缩短病程,提高疾病高峰期坐骨神经传导速度、动作电位振幅,减轻炎症反应,促进神经髓鞘及轴突再生。特别在缩短病程,提高疾病高峰期坐骨神经传导速度,促进神经髓鞘再生这几个方面较阳性药物组作用更为显著。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.5;R-332

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