脊髓性肌萎缩症患者尿液细胞系的建立、ips细胞重编程及转分化研究

发布时间：2018-02-25 20:05

  本文关键词： 脊髓性肌萎缩症 尿液细胞 iPS细胞 直接转分化 组蛋白脱乙酰酶抑制剂　出处：《福建医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一类好发于婴幼儿和儿童期的神经遗传疾病,临床上以进行性、对称性的肢体无力和肌肉萎缩为特征,病理上主要表现为选择性脊髓前角运动神经元的变性、坏死。目前尚无有效的治疗手段,是婴幼儿期最常见的致死性遗传疾病之一。患者来源的神经元或运动神经元标本的缺乏是SMA发病机制和药物干预研究的主要瓶颈。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS)是一种由体细胞重编程后逆向分化而来的特殊类型干细胞,与胚胎干细胞类似,具有分化为三个胚层组织的能力。同时,利用特异的谱系表达因子也可实现在不同胚层细胞之间的转分化(direct lineage conversion)。i PS细胞技术和直接转分化技术的出现为获取SMA患者来源的运动神经元提供了新的思路。本实验旨在培养SMA患者无创尿液细胞系,重编程为i PS细胞,并进一步探索由尿液细胞直接转分化为运动神经元,结合尿液细胞和诱导运动神经元进行组蛋白脱乙酰酶抑制剂的干预研究。方法1、收集SMA患者及对照的新鲜中段尿液,离心、沉渣培养,对培养得到的尿液细胞进行形态观察、传代、扩增,建立不同表型患者的尿液细胞系,采用逆转录PCR、Western blot、细胞免疫荧光染色鉴定尿液细胞成分、分析尿液细胞的SMN基因缺陷及SMN蛋白的定位。2、构建OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4慢病毒质粒,扩增、纯化后转导293T细胞包装病毒,以不同的病毒感染复数(MOI)感染尿液细胞,采用形态观察、碱性磷酸酶染色、分子印迹、细胞免疫荧光染色、畸胎瘤形成实验等手段对获得的i PS克隆进行鉴定。3、构建ASCL1、BRN2、MYT1L、NEUROD1、ISL1、HB9、LHX3和NGN2慢病毒质粒,扩增、纯化后转导293T细胞包装病毒,感染尿液细胞和成纤维细胞,采用形态观察、细胞免疫荧光染色、膜片钳等手段对诱导的神经元和运动神经元进行鉴定,同时,对比SMA患者和健康对照的诱导运动神经元的差异,观察SMA表型。4、在尿液细胞和诱导神经元进行组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸钠和辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)的干预,设置不同的浓度和观察时间点,对比干预前后SMN蛋白的表达量和诱导神经元的生长状况及神经元存活情况。结果1、成功建立了13例SMA患者和39例其他神经遗传疾病患者及健康个体的尿液细胞系。大部分的尿液细胞系由梭形和椭圆形两种细胞类型组成,尿液细胞成分复杂,主要包括肾脏足突细胞、尿道上皮细胞和尿液间充质干细胞。尿液细胞增殖能力旺盛,能稳定扩增6-10代。SMA患者来源的尿液细胞天然携带有SMN基因缺陷,在胞浆和胞核均有SMN蛋白的表达,是SMA一种新的细胞模型。2、构建了OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4的慢病毒质粒、包装病毒、感染尿液细胞,30天左右获得了i PS克隆,i PS细胞表达高活性的碱性磷酸酶和胚胎干细胞标志NANOG、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60及Tra-1-81,并进一步采用畸胎瘤形成实验证实了获得的i PS细胞具备分化为三个胚层组织的能力。3、构建了ASCL1、BRN2、MYT1L和NEUROD1的慢病毒质粒、包装病毒、感染尿液细胞和成纤维细胞,感染后15天左右可见典型的神经元形态,呈两极或多极生长、胞核居中,表达神经元标志Tuj-1。进一步添加ISL1、HB9、LHX3和NGN2因子后,获得了诱导运动神经元,表达HB9和CHAT标志,检测到细胞钠电流和钾电流。此外,诱导的运动神经元具有生长、迁移活性,神经元之间相互联系、形成网络。同时,观察到SMA患者细胞诱导的运动神经元,细胞突起生长速度较对照组慢、细胞存活时间也较短。4、在尿液细胞和诱导运动神经元进行组蛋白脱乙酰酶抑制剂干预后,观察到SMN蛋白表达上调,细胞核中Gems颗粒数增多,且SAHA对诱导运动神经元的生长具有一定的维持作用。结论1、尿液细胞培养步骤简单、尿液收集无创、患儿及其家属接受程度高,是获取和保存病人来源标本的有效方法,尿液细胞成分复杂,主要有肾脏足突细胞、尿道上皮细胞和尿液间充质干细胞。2、OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4四因子能够实现尿液细胞到i PS细胞的重编程,尿液细胞来源的i PS细胞同样具有分化为各个胚层组织的能力。3、ASCL1、BRN2、MYT1L、NEUROD1、ISL1、HB9、LHX3和NGN2八因子能够将尿液细胞和成纤维细胞直接转分化为神经元和运动神经元,获得病人来源的神经元模型。4、组蛋白脱乙酰酶抑制剂能够上调SMN蛋白的表达和Gems颗粒数,维持诱导运动神经元的生长。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R746.4

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本文编号：1534958