氯化两面针碱和橄榄苦苷对胶质瘤的抑制作用及机制的研究

发布时间：2018-02-27 12:07

本文关键词： 胶质瘤氯化两面针碱橄榄苦苷 AKT 凋亡侵袭　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景恶性胶质瘤,包括间变型星形细胞瘤(Anaplastic astrocytoma AA),胶质肉瘤(gliasarcoma)和多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme GBM),起源于中枢神经系统的胶质细胞,是颅内最常见的恶性肿瘤。尽管这些肿瘤仅占成人全部肿瘤的2%,但他们仍然是肿瘤导致死亡的第4大原因,严重威胁人类健康。以GBM为例,男性多见,男女比例为1.6：1,平均生存期为14.6个月。目前主要治疗方式为手术切除+放疗+化疗,但由于恶性胶质瘤生长快,侵袭性强,即使手术后辅助放疗和化疗,患者的远期生存期也并没有明显增长。过去一段时间,不断出现治疗胶质瘤的新思路、新理念,新方法,但这些在临床上并未获得显著成功。凋亡和侵袭与胶质瘤发生发展的过程密切相关。有研究提示,在胶质瘤发展过程中,凋亡减少所起到的作用甚至要大于细胞快速增殖所起到的作用,细胞凋亡功能的异常有可能在胶质瘤的发展中起主导作用。大量证据已经证实,不同的凋亡通路在胶质瘤进展过程中被激活,此过程涉及诸多凋亡相关分子,如Bcl-2、Bax、casepase-3、casepase-9、Cyto-C、P53、Survival等。而且,这些分子的表达有些与胶质瘤的恶性程度呈正相关,对判断患者的预后有着重要意义。Bcl-2和Bax同属Bcl-2家族,Bcl-2有抗凋亡作用而Bax有促凋亡作用。P53是一个与凋亡有关的抑癌基因,野生型P53主要通过上调Bax的基因转录来间接促进细胞的凋亡。可见凋亡与胶质瘤的发生有着非常密切的关系。目前有人提出胶质瘤化疗的新理念,即怎样更有效的诱导肿瘤细胞的凋亡。所以,通过不断深入研究胶质瘤凋亡的机制,找到正确的靶点或者有效药物促进胶质瘤细胞的凋亡过程,将为胶质瘤的治疗提供革命性的创新。同时,胶质瘤的不断扩散与其强大的侵袭性密不可分。尸检报告,45%GBM的生长范围超过一个脑叶,25%侵及整个大脑半球,25-30%的肿瘤可以侵犯到对侧半球。胶质瘤的扩散类型包括邻近部位扩散、远处复发、多发性胶质瘤,其主要扩散途径还是沿白质邻近扩散侵犯附近的脑实质。而从微观结构上分析,胶质瘤细胞的侵袭性是破坏了细胞外基质分子和细胞面表面的粘附分子。胶质瘤细胞侵袭的主要执行者是基质金属蛋白酶家族(MMPs),尤其是MMP2和MMP9,能够降解多种细胞外基质成份,破坏正常脑实质的组织学屏障,因此本课题试图寻找有效药物来抑制MMP2和MMP9的活性或者减少两者的表达,从而减弱或阻断胶质瘤的侵袭。目前,临床上还没有专门促进胶质瘤细胞凋亡和控制其侵袭力的药物,主要化疗药物还是以替莫唑胺(TMZ)为主,利用细胞毒性发挥其药理作用,不良反应小,但价钱昂贵,加上患者耐药性的增加,所以寻找更好的化疗药物显得尤为重要。如今,关于中医药的研究得到不断发展,很多临床证据证实,某些中医药对脑胶质瘤的发展具有很强的抑制作用。氯化两面针碱(Nitidine chloride)是一种天然活性成分,大量研究表明它能够抑制多种肿瘤的恶性生物学行为,而且AKT、ERK等信号转导通路在NC抑制肿瘤细胞的生长过程中起到重要作用。但目前氯化两面针碱对胶质瘤细胞发生发展的研究尚未报道,关于其发挥抗癌作用所涉及的信号通路也尚不明确,所以本课题将探讨NC对胶质瘤的作用,并对作用机制做相应探索。橄榄苦苷(Oleuropein)也是一种天然活性成分,主要从橄榄叶中提取而成,据相关文献报道,它在很多肿瘤中表现出抗癌作用,其发生作用的关键细胞信号通路包括MAPK、PI3K等。然而,关于橄榄苦苷对人胶质瘤的作用及相关机制至今甚少报道。本课题的第二部分就橄榄苦苷对胶质瘤细胞发展过程的影响进行检测,并对其作用机制做进一步研究。本课题重点研究两面针碱和橄榄苦苷对胶质瘤的作用,并探索这两种药物发挥作用的相应机制,为胶质瘤的药物治疗拓宽新道路。目的1.氯化两面针碱抑制脑胶质瘤细胞的生长：(1)检测氯化两面针碱对胶质瘤细胞活性和增殖的影响。(2)检测氯化两面针碱对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。(3)检测氯化两面针碱对胶质瘤细胞线粒体膜电位、线粒体形态、乳酸和ATP生成量的影响。(4)探讨氯化两面针碱对胶质瘤细胞PI3K/AKT/mTOR通路的作用。2.橄榄苦苷抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭：(1)检测橄榄苦苷对胶质瘤细胞活性和增殖的影响。(2)检测橄榄苦苷对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。(3)检测橄榄苦苷对胶质瘤细胞凋亡的影响。(4)探索橄榄苦苷对AKT、P38、ERK、JNK通路的作用。(5)探索橄榄苦苷对AKT通路下游分子(P53、Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-9、 MMP-3和MMP9)的作用。方法1.NC抑制脑胶质瘤细胞的生长(U87和U251胶质瘤细胞作为研究对象)：(1)CCK-8和EdU实验检测NC对胶质瘤细胞增殖的影响。(2)划痕和Transwell试验检测NC对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。(3)JC-1探针法检测NC对胶质瘤细胞线粒体膜电位的影响；应用Mitotracer探针检测NC对线粒体形态的影响：应用试剂盒检测NC对胶质瘤细胞ATP及乳酸生成的影响。(4) Western-Blot技术检测胶质瘤细胞中与凋亡过程有关蛋白分子和DRP-1、 Mfn-z表达水平,探讨NC对胶质瘤PI3K/AKT/mTOR通路及下游有关分子的关系。(5)以四周龄的BALB/c裸鼠为研究对象,将100μL细胞液(含有1×107荧光素酶标记的U87细胞)注射到小鼠右侧大脑额叶并将小鼠随机分成两组：实验组和对照组,每组5只,口服药物500mg/kg/day,每周5次,连续4周,对照组给予生理盐水。每14天应用小动物活体成像系统测量肿瘤体积。记录两组小鼠生存时间。2.橄榄苦苷通过抑制AKT通路的活性抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭(A172和U251胶质瘤细胞为研究对象)：(1)CCK-8实验方法检测橄榄苦苷对胶质瘤细胞增殖的影响。(2)划痕和Transwell试验检测橄榄苦苷对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。(3)流式细胞技术研究橄榄苦苷对细胞凋亡的影响。(4) Western-Blot技术检测Oleuropein对胶质瘤细胞内AKT、P38、ERK、JNK通路及下游分子(P53、Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-9、MMP-3和MMP9)的作用。结果1.氯化两面针碱抑制脑胶质瘤细胞的生长：(1)CCK-8结果显示：氯化两面针碱能够明显抑制U251和U87细胞增殖,与药物浓度呈正相关。(2)划痕和Transwell试验结果显示：氯化两面针碱能够明显抑制U251和U87细胞的迁移和侵袭。(3)线粒体膜电位实验结果显示：氯化两面针碱能够使胶质瘤细胞线粒体膜电位降低：免疫荧光素染色结果显示氯化两面针碱对线粒体形态产生影响,线粒体融合现象减少,而分裂情况增加；氯化两面针碱能够降低胶质瘤细胞ATP及乳酸的生成。(4) Western-Blot结果显示：氯化两面针碱能够明显抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性,同时Bax和Cyto-C的表达明显上调,而Bcl-2的表达下调,说明氯化两面针碱可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性来对胶质瘤细胞的生长产生影响。(5)小鼠原位植瘤实验验证了氯化两面针碱对胶质瘤细胞的抑制作用,肿瘤细胞的生长速度和肿瘤体积都受到明显抑制。实验组小鼠生存时间较对照组明显增长。2.橄榄苦苷通过抑制AKT通路的活性抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭(1)CCK-8结果显示：橄榄苦苷能够明显抑制U251和A172细胞增殖,并且与药物浓度正相关。(2)划痕和Transwell试验结果显示：橄榄苦苷对U251和A172细胞的迁移和侵袭能力产生抑制作用。(3)流式细胞技术显示：U251和A172细胞的凋亡数明显升高。(4) Western-Blot技术证实,橄榄苦苷治疗后p-AKT的表达水平降低,而P38、 ERK、JNK通路的活化水平未见明显改变,而且能够下调MMP2,MMP9的表达,另一方面上调Bax的表达和下调Bcl-2的表达。结论1.氯化两面针碱能够抑制胶质瘤细胞生长,对胶质瘤细胞的代谢产生影响,并且通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性,影响其下游Bax, Bcl-2,及Cyto-C的表达。2.橄榄苦苷能够抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭,在机制上,橄榄苦苷通过AKT信号通路促进胶质瘤细胞的凋亡,从而抑制胶质瘤细胞的增殖；另一方面,橄榄苦苷作用后的MMP2, MMP9的表达水平降低,有效抑制了胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【参考文献】