TRPV1受体在新生鼠缺血缺氧性脑损伤中的作用及牡荆素干预研究

发布时间：2018-02-28 14:33

  本文关键词： TRPV1 离子通道 牡荆素 辣椒素 HIF-1α　出处：《武汉大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：导致围产期新生儿脑损伤的原因有很多,包括脑缺血缺氧、宫内感染以及脑出血等,其中脑缺血缺氧是最常见的原因。新生儿脑缺血缺氧常常造成极高的死亡率及远期的神经发育障碍。近年来研究发现,神经元的兴奋性中毒、凋亡及炎症的发生等参与了新生儿缺血缺氧性脑损伤的发病机制。在这个过程中,细胞内钙离子的聚集可以造成严重的细胞毒性损伤。之前大量研究表明,脑损伤时钙离子的内流主要由谷氨酸受体所介导。但近年来研究发现,TRP家族的受体也参与调节脑损伤病理过程中钙离子的内稳态。瞬时受体电位香草酸亚型1 (Transient receptor potential vanilloidl)受体-TRPV1受体又称辣椒素受体,是主要介导Ca2’内流的非选择性阳离子通道,是TRP超家族的一员。TRPV1受体主要表达于伤害感受器上,如：背根神经节和三叉神经节的初级感觉神经元特定亚群,主要是探测机体受到的有害刺激,可以被辣椒素,热刺激或者是酸所激活。最近有大量的研究表明TRPV1在中枢神经系统CNS (central nervous system)也广泛表达。当脑损伤时,TRPV1会被大麻素和脂肪氧合酶产物所激活而加重脑损伤。因此,TRPV1可能是治疗脑损伤的药物潜在靶点。牡荆素是许多药用植物中含有c-糖基化的黄酮类物质之一。近年来,牡荆素因其广泛的药理作用而受到人们的关注。有研究指出牡荆素可以作为TRPV1潜在的抑制剂,减少疼痛伤害的行为。此外,黄酮类物质剑叶龙血素B在大鼠背根神经节上,可以抑制辣椒素所介导的激活电流。因此,牡荆素可以作为体内和体外研究TRPV1功能的潜在药物工具。新生大鼠脑缺血缺氧性损伤时,早期抑制低氧诱导因子HIF-1α(Hypoxic Inducible Factor-1α)的表达可以产生神经保护作用。与此同时,有研究指出牡荆素是低氧诱导因子HIF-1α (Hypoxic Inducible Factor-1α)的抑制剂。目的：(1)通过比较新生的Trpvl敲除小鼠和野生型小鼠在遭受缺血缺氧性脑损伤后,脑梗死、脑萎缩程度及动物行为学评分等,初步验证TRPV1受体在新生小鼠缺血缺氧脑损伤中的作用。(2)通过不同实验手段验证牡荆素干预治疗新生小鼠缺血缺氧性脑损伤的效果,并且探讨其药理作用的机制及进一步阐明TRPV1受体在新生小鼠缺血缺氧性脑损伤中的具体作用。(3)运用新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型,验证牡荆素针对其他靶点发挥其神经保护的作用。方法：(1)9日龄C57BL/6 trpvl敲除小鼠及野生型小鼠构建HIBD模型。并运用TRPV1受体的激动剂辣椒素干预治疗,进行TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色、Nissl染色及动物行为学等检测,初步阐明TRPV1受体在新生小鼠HIBD中的作用。(2)9日龄C57BL/6小鼠构建HIBD模型,对小鼠给予不同剂量的牡荆素预处理,通过TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色初步确定最佳给药剂量。同时运用Nissl染色、TUNEL染色及动物行为学等检测,初步验证牡荆素对新生小鼠HIBD的神经保护作用。(3)选取24小时内出生的C57BL/6小鼠进行原代皮层神经元培养,培养到第12天时进行OGD造模。通过MTT法、LDH释放量以及PI染色等检测,验证牡荆素在原代培养的皮层神经元上的保护作用。(4)利用Fura-2/AM荧光标记探针对经过OGD造模后的原代皮层神经元进行胞内钙离子的测定,并结合全细胞膜片钳技术,验证牡荆素对TRPV1受体激活电流的作用。同时,利用Western blot进一步检测牡荆素对TRPV1受体表达的影响。(5)利用Western blot手段检测体内及体外一系列信号通路相关的蛋白(CaMKII/p-CaMKII及凋亡蛋白)造模后的不同组表达变化。(6)选取7日龄的SD (Sprague Dawley)新生大鼠构建HIBD模型,造模后对新生大鼠进行不同剂量和不同时间的牡荆素干预治疗。通过TTC(2,3,5-一水氯化三苯基四氮唑)染色初步确定最佳给药剂量及时间。同时运用Nissl染色、脑水肿检测、IgG染色、脑萎缩检测、足失误及Morris水迷宫等方法,探究牡荆素的神经保护作用。(7)通过Western blot和免疫组化的方法,检测HIF-1α和VEGF在造模后不同组间的变化。结果：(1)TTC染色的结果显示：缺血缺氧造模后,新生的trpvl敲除小鼠脑梗死体积较野生型小鼠显著减少,并且对野生型小鼠给予TRPV1受体的激动剂辣椒素预处理,也呈现出药物剂量依赖性的保护作用。但是,造模后给予辣椒素未见该保护效应。Nissl染色和动物行为学检测得到了同样的结果。(2)小鼠进行牡荆素预处理后,给药组较模型组脑梗死体积明显减少并呈现剂量依赖性。同时,在脑萎缩和TUNEL染色结果均显示：牡荆素预处理可以减少因缺血缺氧所造成的脑损伤。同时,牡荆素还能提高远期神经行为学的评分。(3) 原代神经元经氧糖剥夺造模后,发现牡荆素可显著降低神经元的死亡率及LDH的释放量。同时,PI染色的结果也证实了牡荆素的神经保护效应。(4) Fura-2/AM荧光标记探针对经过OGD造模后的原代皮层神经元进行胞内钙离子浓度的测定,发现牡荆素可以显著降低神经元胞内钙离子的浓度。电生理实验则发现牡荆素可以抑制因辣椒素所引起的电流;Western blot结果提示牡荆素并不能改变神经元TRPV1受体的表达。(5) Western blot结果显示：牡荆素组可显著提高脑损伤区域(皮层)Bcl-2/Bax的比例、而降低p-CaMKII/CaMKII、NF-κB和cleaved caspase-3蛋白的表达。同时,在原代皮层神经元上也得到了同样的结果。(6)TTC染色的结果显示：缺血缺氧造模后,经牡荆素早期(造模5 min后)干预治疗的新生大鼠较模型组脑梗死体积明显减少,并且呈一定剂量依赖性。但是,牡荆素(造模3h后)干预治疗则未见该神经保护作用。牡荆素最佳的药物剂量可以明显改善脑水肿情况、血脑屏障的破坏程度、神经元的死亡、脑萎缩以及长期的动物行为学指标等。而较模型组而言,低氧诱导因子的激动剂(DMOG)则加重了脑水肿以及血脑屏障的的破坏程度。(7) Western blot及免疫组化的结果显示：牡荆素可以明显降低因缺血缺氧所造成的高表达的低氧诱导因子及血管内皮生长因子。结论：(1)我们发现新生的trpv1敲除小鼠可以显著减少缺血缺氧所造成的伤害,并且TRPV1受体的激动剂辣椒素预处理可以对其产生神经保护作用。说明TRPV1受体的脱敏抑制可能对新生小鼠缺血缺氧性脑损伤产生保护效果。(2)预处理牡荆素可以通过减少脑梗死体积、抑制促凋亡的信号通路及提高行为学评分,从而对新生小鼠缺血缺氧性脑损伤产生保护作用。而此神经保护作用可能是牡荆素抑制了TRPV1受体的过度激活。(3)在新生大鼠脑缺血缺氧损伤中,牡荆素可以通过抑制低氧诱导因子,减少脑梗死体积、保护血脑屏障的完整性及脑水肿等,从而提供短期及长期的神经保护作用。
[Abstract]:In recent years , it has been found that trpv1 can be used as a latent drug tool for the treatment of brain injury . The protective effects of vitexin on neonatal rat HIBD were studied by means of MTT assay , TUNEL staining and animal behavior . ( 1 ) The results showed that vitexin could significantly reduce the brain damage caused by ischemia and hypoxia . ( 6 ) The results of TTC staining showed that the cerebral edema and vascular endothelial growth factor were significantly reduced by the intervention of vitexin ( after 5 min ) .

【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743
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本文编号：1547694