组蛋白H3K9甲基化转移酶SETDB1对神经母细胞瘤增殖与分化的调控研究

发布时间：2018-03-01 05:19

本文关键词： 神经母细胞瘤 SETDB1 细胞生长与增殖分化嘌呤核苷酸合成　出处：《重庆大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：神经母细胞瘤是儿童常见的颅外实体肿瘤之一，约占儿童肿瘤的6-10%，年发病率大约为1/10万，仅低于白血病和中枢神经系统肿瘤，占儿童癌症死亡的15%。神经母细胞瘤是一种神经内分泌性肿瘤，主要起源于交感神经系统中的神经嵴祖细胞，其最常见的发生部位是肾上腺，也可以发生于颈部、胸部、腹部等的神经组织。神经母细胞瘤临床表现为恶性程度高、异质性高、易转移、易复发以及预后差等特点，因此神经母细胞瘤的治疗比较困难，除少数可自行退化缓解或早期可完全切除以外，其余病例预后较差，即使经过多种手段联合治疗其长期生存率仍然小于40%。因此，研究神经母细胞瘤的发病机理，探索影响该肿瘤细胞增殖与分化的关键靶点，并阐释这些靶点对其增殖与分化的作用机理，可以为临床治疗神经母细胞瘤提供新策略和新方法。表观遗传调控肿瘤细胞生长是当前研究热点之一，许多实验证据显示组蛋白甲基化对肿瘤的生长增殖有着十分重要的影响。组蛋白甲基化转移酶通过参与组蛋白甲基化，对肿瘤的生长演进起着重要的作用，因此研究组蛋白甲基化转移酶的功能及作用机制，有重要的理论及临床价值。SETDB1是一种组蛋白甲基化转移酶，主要参与H3K9me3的甲基化，现有的研究结果显示SETDB1参与小鼠的胚胎发育，特别是对神经系统发育有十分重要的影响，对肿瘤的增殖和生长也具有重要影响。但在神经母细胞瘤中的研究尚未见报道。本研究以组蛋白甲基化转移酶SETDB1及神经母细胞瘤细胞作为研究对象，利用现有的神经母细胞瘤的临床数据库中患者的表达谱芯片数据，分析SETDB1与神经母细胞瘤预后之间的关系。通过构建上调和下调SETDB1的慢病毒质粒对神经母细胞瘤进行转染，检测上调或下调神经母细胞瘤细胞中SETDB1的表达水平，研究SETDB1对神经母细胞瘤细胞增殖分化调控作用的分子机制，为神经母细胞瘤的临床治疗新策略提供理论依据。本研究获得的主要研究结果如下： ①组蛋白甲基化转移酶SETDB1与神经母细胞瘤预后的关系分析利用神经母细胞瘤临床在线数据库，检索组蛋白甲基化转移酶SETDB1在神经母细胞瘤患者基因组表达谱中的表达情况，分析SETDB1的表达量与神经母细胞瘤预后的关系。结果显示，SETDB1的表达量与神经母细胞瘤患者的预后呈显著相关，SETDB1表达量越高，患者的总体存活率越低，复发率高，预后差；反之，SETDB1表达量低，患者总体存活率高，预后较好。神经母细胞瘤的治疗效果与诊断时患儿的年龄及临床分期有关，患儿年龄越大，分期越后，肿瘤越容易扩散，则预后越差，而患儿诊断年龄18个月被定义为决定风险的关键年龄节点。通过分析发现，SETDB1随着神经母细胞瘤分期的进展，SETDB1表达也有差异，其中在IV（st4）期患者中SETDB1的表达量显著升高。在患儿诊断年龄≤18个月时，SETDB1的表达量低，在患儿诊断年龄18个月时，SETDB1的表达量显著增高。进一步的分析发现在因肿瘤致死的患者中，SETDB1的表达量显著高于未死亡患者。同时我们发现SETDB1的表达量与神经母细胞瘤原癌基因N-MYC的扩增呈正相关，N-MYC的扩增与神经母细胞瘤的发生及复发有紧密联系，由于神经母细胞瘤起源于胚胎发育过程中的神经嵴细胞，因此我们推测SETDB1可能参与调控原癌基因或抑癌基因在胚胎发育过程中的表达，使交感神经系统发育的调控系统发生紊乱，从而促使神经母细胞瘤的形成。基于以上分析，我们推测SETDB1可以作为神经母细胞瘤患者风险分层中的重要参考指标。 ②组蛋白H3K9甲基化转移酶SETDB1对神经母细胞瘤细胞生长增殖的影响为了研究SETDB1对神经母细胞瘤细胞生长增殖的影响及其分子机制，本研究通过构建上调及下调SETDB1的慢病毒转染质粒，对神经母细胞瘤感染SETDB1si慢病毒，研究下调SETDB1对神经母细胞瘤增殖的影响。结果表明，SETDB1si干涉后，，神经母细胞瘤细胞的生长受到抑制，细胞形态发生显著变化，细胞数量明显减少。利用CCK8试剂盒检测细胞增殖的生长曲线，结果显示SETDB1si干涉后神经母细胞瘤细胞增殖基本完全被抑制。同时采用BrdU、Ki67等增殖标记对神经母细胞瘤细胞进行免疫荧光实验，结果发现SETDB1si干涉后BrdU阳性率及Ki67阳性率都显著降低。进一步利用流式细胞仪检测细胞周期，结果表明下调SETDB1引起细胞周期阻滞在G1期。通过Western blotting检测Cyclin和CDK的表达显示，SETDB1si干涉后，G1期特异性Cyclin和CDK2的蛋白表达水平明显降低，暗示着SETDB1可能调控G1期特异性Cyclin和CDK2的表达，促使细胞周期阻滞在G1期，从而抑制细胞增殖。通过软琼脂实验结果显示下调SETDB1降低了神经母细胞瘤的克隆形成能力，利用免疫缺陷鼠构建SETDB1si的小鼠移植模型，结果发现SETDB1si后的神经母细胞瘤细胞不能在免疫缺陷鼠中长出肿瘤。为了进一步探索SETDB1对神经母细胞瘤的增殖，我们对下调SETDB1后的细胞进行恢复SETDB1的表达实验，结果发现恢复SETDB1的表达后，神经母细胞瘤的增殖和生长、克隆形成能力及在免疫缺陷鼠体内的成瘤能力都得到了恢复。这些结果表明，下调SETDB1对神经母细胞瘤的增殖具有明显的抑制作用。 ③组蛋白H3K9甲基化转移酶SETDB1对神经母细胞瘤嘌呤核苷酸合成的影响为了探讨下调SETDB1引起神经母细胞瘤增殖抑制的分子机制，本研究对SETDB1si干涉后的神经母细胞瘤细胞进行表达谱分析，与对照GFPsi相比，发现下调SETDB1影响嘌呤代谢相关途径。进一步的分析研究发现，SETDB1si干涉后嘌呤从头合成途径的关键酶基因显著下调。通过CCK-8细胞增殖实验发现，在SETDB1si后的神经母细胞瘤中补偿20μM的IMP，AMP，GMP之后，神经母细胞瘤的生长得到部分恢复。嘌呤从头合成途径关键酶PRPS1作用是将5-磷酸-核糖催化生成5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP），而PRPP是嘌呤从头合成途径中的第一个中间产物。通过对PRPS1进行干涉，结果发现下调PRPS1也出现了类似下调SETDB1的效果，如细胞增殖受到抑制，细胞的克隆能力减弱等。这些结果暗示下调SETDB1引起神经母细胞瘤增殖受到抑制与SETDB1si干涉后抑制了嘌呤核苷酸合成有关。 ④组蛋白H3K9甲基化转移酶SETDB1对神经母细胞瘤细胞分化影响的初步研究有报道显示肿瘤中存在一小群细胞，其能够引发肿瘤的发生发展并维持肿瘤的“干性”特征，称为肿瘤干细胞，其具有无限复制、自我更新能力以及分化潜能。临床研究表明在低龄儿童的神经母细胞瘤患者中，有少部分病人可以自发转化成良性肿瘤，或者自行消退，即在极少甚至无系统治疗的情况下肿瘤缩小甚至消失的现象。有研究报道神经母细胞瘤BE(2)-C细胞可以通过维甲酸诱导向神经元方向分化，表达神经元标记物，如NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2、DBH等，也可以在BrdU的诱导下向胶质细胞分化，表达胶质细胞标记（GFAP、Vimentin、ALDH1L1等）。Bmi-1、MYCN、Nestin等基因在维持神经母细胞瘤的“干性”中扮演着十分重要的作用。在研究SETDB1的过程中，我们发现上调SETDB1并没显著的增加神经母细胞瘤的增殖能力，但是软琼脂实验显示明显增加了神经母细胞瘤的自我更新能力。这说明上调SETDB1增加了神经母细胞瘤的自我更新能力。对细胞形态的的观察发现，下调SETDB1引起细胞表型显著变化，出现分化表型。通过对表达谱芯片数据进行分析，发现下调SETDB1引起了维持神经母细胞瘤“干性”基因和神经元标记基因的表达量下降，而神经胶质细胞标记的表达量升高。进一步的通过荧光定量PCR检测分析，发现下调SETDB1引起了神经母细胞瘤的“干性”维持基因MYCN、Bmi-1的表达量显著下降，神经元标记如NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2及DBH等表达量显著降低，但是神经胶质细胞标记GFAP、Vimentin、ALDH1L1等表达量明显升高。而恢复SETDB1的表达，MYCN、Bmi-1的表达得到显著提高，神经元标记基因NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2及DBH等也显著恢复，但是神经胶质细胞标记GFAP、Vimentin、ALDH1L1显著降低。这些结果暗示下调SETDB1会促进神经母细胞瘤向神经胶质细胞分化。以上实验结果显示：SETDB1si干涉后引起神经母细胞瘤生长、增殖受到抑制，下调SETDB1抑制嘌呤核苷酸的从头合成。 SETDB1与神经母细胞瘤的“干性”维持密切相关，下调SETDB1使神经胶质细胞标记基因表达增加。SETDB1对神经母细胞的增殖和分化具有重要的作用，这对于进一步了解神经母细胞瘤的发病机制，探索神经母细胞瘤新的治疗靶点提供了一定理论依据。
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【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4

【参考文献】