脑出血患者血肿周围脑组织中NF-κB的表达及其与细胞凋亡关系研究

发布时间：2018-03-03 17:20

本文选题：脑出血　切入点：NF-κB　出处：《山东大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的脑出血是神经科常见的急症,病死率及致残率高,40%的存活者遗留严重残疾,是威胁中老年人健康的主要疾病之一,并且在近些年发病呈年轻化趋势。目前,尚缺乏有效的手段治疗脑出血导致的神经功能缺损。国内外研究表明在大鼠脑出血模型中,血肿周围存在大量炎性细胞浸润,炎性反应是脑出血继发性神经损伤的重要机制,NF-κB在脑出血炎性反应中起中心调控作用,多种炎性因子如TNF-α、IL-1β等均为其下游因子,与中枢神经免疫细胞即小胶质细胞的增生以及神经细胞凋亡关系密切。另有动物模型实验表明,可通过干预NF-κB活化的方法来减少神经细胞的凋亡。但目前对脑出血患者血肿周围组织的炎性因子表达以及其与神经细胞凋亡关系的深入研究甚少。因此,本研究收集了山东大学齐鲁医院急诊外科基底节区脑出血患者53例,对其临床资料及血肿周围的脑组织进行研究,分析NF-κB和其介导的炎性因子IL-1β、TNF-α的表达规律及其与细胞凋亡的关系,为今后是否可通过干预NF-κB表达的方法治疗人类脑出血,改善患者预后提供理论依据。资料与方法 1、临床资料与分组：选取山东大学齐鲁医院急诊外科2010年11月至2012年11月收治的基底节区脑出血患者53例为实验组,入组要求为血肿量40m1-80ml,并且开颅沿无功能区行脑皮层造瘘血肿清除手术的患者。其中男33例,占62.26%,女20例,占37.74%；年龄30-70岁,平均56.7岁；术前GCS评分4-14分,其中13-14分6例,9-12分32例,4-8分15例。根据发病及标本采集时间分为6组,其中A组8例：≤6小时,B组14例：7-12小时,C组12例：13-24小时,D组8例：25-48小时,E组6例：49-96小时,F组5例：96小时。选取经皮层造瘘行脑室手术治疗良性病变的患者8例为对照组(Ctrl),其中男5例,女3例；年龄30-69岁,平均年龄54.3岁。所收集脑组织均为正常手术过程中丢弃的废弃脑组织,所有病例均已术前征得患者家属的书面知情同意及医院伦理委员会的书面同意。共同排除标准：排除有引起待检测因子变化的其他因素：1月内存在出血、炎症、创伤、手术等情况,存在全身某个器官或系统的基础疾病或其他肿瘤,1月内应用影响免疫系统的药物等。 2、标本采集：实验组取皮层造瘘通道血肿周围1cm处的脑组织块,对照组取皮层造瘘通道灰白质交界处的脑组织块,取下后分为2部分,其一迅速用10%福尔马林固定,待行HE染色,免疫组织化学检测,以及细胞凋亡检测；其二迅速放入液氮罐并于半小时内转移至-80℃冰箱内,待行逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western Blot检测。 3、mRNA水平检测：提取脑组织总RNA,应用RT-PCR方法测定NF-κB p65、 IL-1β、TNF-α mRNA的表达水平。所用引物序列：人NF-κB p65(321bp):F:5'-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3', R:5'-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3';人IL-1β(442bp):F:5'-ATAAGCCCACTCTACAGCT-3', R:5'-ATTGGCC CTGAAAGGAGAGA-3';人TNF-α (325bp):F:5'-CAGAGGGAAGAGTTC CCCAG-3', R:5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3';人β-actin (539bp):F:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', R:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。 4、蛋白水平检测：应用核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)分离核蛋白及胞浆蛋白,分别应用HSP90和HDAC-1作为浆蛋白和核蛋白的内参,检测提取纯度,结果示提取纯度高。每份样本提取核蛋白,Western Blot方法检测细胞核中NF-κB p65的表达水平,以此判断活化入核的NF-κB水平；提取胞浆蛋白,Western Blot方法检测IL-1β、TNF-α的表达水平。所用一抗：NF-κB p65抗体(B7162兔多抗,ANBO,美国),IL-1p抗体(AP8531c兔多抗,ABGENT,美国),TNF-α抗体(ab9579鼠单抗,abcam,美国)；二抗：辣根酶标记的山羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch,美国),辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch,美国)；蛋白浓度应用微量BCA蛋白测定试剂盒测定(Thermo Fisher Scientific Inc.,美国)。 5、免疫组织化学检测：常规石蜡切片行HE染色,然后根据二步法免疫组化试剂盒要求操作。在普通显微镜下观测结果,400×高倍镜下随机选取5个无重复视野,统计细胞核NF-κB p65表达阳性及细胞浆IL-1β、TNF-α表达阳性的细胞数,结果以5个视野阳性细胞总数表示。所用一抗：同Western Blot;二抗：非生物素兔超敏二步法二抗(PV-9001, GBI公司,美国),非生物素小鼠超敏二步法二抗(PV-9002,GBI公司,美国)。 6、细胞凋亡检测:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL法),根据试剂盒(Roche公司,德国)要求操作,荧光显微镜(Olympus BX51)下及DAB显色后普通显微镜下观测结果,400×高倍显微镜下随机选取5个无重复视野,统计凋亡细胞数,结果以5个视野阳性细胞总数表示。 7、统计方法：病理切片采用DP70数码显微成像系统及图像处理软件(DPController, DP Manager)采集分析。应用SPSS19.0统计学分析软件及Excel2003软件行统计学分析及图表制作,数据用均数±标准差表示,两组间均数比较采用T检验,两变量之间的相关分析采用皮尔逊相关系数(Pearson's correlation coefficient)分析,P0.05被认为有统计学意义。结果 1、脑出血血肿周围脑组织中NF-κB介导的炎性因子表达水平及时间变化规律 (1) NF-κB p65、IL-1β、TNF-α mRNA水平的表达及时间变化规律 NF-κB p65、IL-1β、TNF-α mRNA水平的表达在各实验组均与对照组存在显著性差异(P0.001)。NF-κB p65mRNA在脑出血后表达水平逐渐升高,在13-24小时组表达水平最高,其与7-12小时及25-48小时组相比未见显著性差异(PB/C、PC/D0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PA/C、PC/E0.001),提示7-48小时为其表达高峰时段；IL-1β mRNA在≤6小时组表达水平最高,其与7-12小时组相比未见显著性差异(PA/B0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PA/C0.05,PA/F0.001),提示12小时内为其表达高峰时段；TNF-α mRNA在脑出血后表达水平逐渐升高,在7-12小时组表达水平最高,其与13-24小时组相比未见显著性差异(PB/C0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PA/B、PB/D、0.001),提示7-24小时为其表达高峰时段。 (2) Western Blot方法检测IL-1β、TNF-α、核蛋白NF-κB p65的蛋白水平表达及时间变化规律胞浆蛋白IL-1β、TNF-α以及核蛋白NF-κB p65的蛋白水平表达在各实验组均与对照组存在显著性差异(P0.001)。核蛋白中NF-κB p65在脑出血后表达水平逐渐升高,在25-48小时组表达水平最高,其与13-24小时组相比未见显著性差异(PC/D0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PB/D0.05,PA/D、 PD/E0.01),提示13-48小时为其表达高峰时段；胞浆蛋白中IL-1p在≤6小时组表达水平最高,其与7-12小时及13-24小时组相比均未见显著性差异(PA/B、PA/C0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PA/D、PA/E0.01),提示24小时内为其表达高峰时段；胞浆蛋白中TNF-α在脑出血后表达水平逐渐升高,在13-24小时组表达水平最高,其与25-48小时组相比未见显著性差异(PC/D0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PA/C、PB/C0.05,PC/E0.005),提示13-48小时为其表达高峰时段。 (3)免疫组化方法检测NF-κB p65、IL-1β、TNF-α的蛋白水平表达及时间变化规律各实验组免疫组化检测显示,NF-κB p65在神经元细胞及胶质细胞细胞核内表达,提示NF-κB已被活化并转移至细胞核内,各实验组NF-κB p65细胞核表达阳性细胞数均与对照组存在显著性差异(P0.001),脑出血后阳性细胞逐渐增多,在13-24小时组达到最多,其与25-48小时组相比未见显著性差异(PC/D0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PB/C0.05,PA/C、PC/E0.001),提示13-48小时为其表达高峰时段;IL-1p在神经元细胞及胶质细胞细胞浆中表达,各实验组IL-1β表达阳性细胞数均与对照组存在显著性差异(P0.001),实验组中,≤6小时组阳性细胞最多,其与7-12小时及13-24小时组相比均未见显著性差异(PA/B、PA/C0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PA/D0.05,PA/W0.01),提示24小时内为其表达高峰时段；TNF-α在神经元细胞及胶质细胞细胞浆中表达,各实验组TNF-α表达阳性细胞数均与对照组存在显著性差异(P0.001),脑出血后阳性细胞数逐渐增多,在25-48小时组最多,其与13-24小时组相比未见显著性差异(PC/D0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PB/D0.05,PA/D、PD/E0.01),提示13-48小时为其表达高峰时段。 2、TUNEL法检测脑出血血肿周围脑组织中细胞凋亡情况及时间变化规律应用TUNEL法检测脑出血血肿周围脑组织细胞凋亡,荧光显微镜下及DAB显色后普通显微镜下均可见大量TUNEL阳性细胞,神经元细胞及胶质细胞均存在凋亡情况；各实验组凋亡细胞数均与对照组存在显著性差异(P0.001),脑出血后凋亡细胞逐渐增多,在25-48小时组最多,其与13-24小时组相比未见显著性差异(PC/D0.05),与其余各时间组相比均存在显著性差异(PD/E0.05,PB/D、PD/F0.001),提示13-48小时为细胞凋亡高峰时段。 3、细胞凋亡与NF-κB活化、IL-1p及TNF-α的关系细胞核NF-κB p65、细胞浆IL-1β及TNF-α蛋白水平的表达高峰时段别为13-48小时、24小时内及13-48小时,Western Blot及免疫组化方法测定结果一致,TUNEL法测定细胞凋亡高峰时段为13-48小时,提示细胞凋亡与细胞核NF-κB p65的表达存在一致的变化规律。采用皮尔逊相关系数分析细胞核NF-κBp65表达阳性细胞数与凋亡细胞数的相关性,结果显示两者存在明显的线性相关(P0.0001)。结论 1、脑出血后血肿周围脑组织中活化入核的NF-κB以及IL-1β、TNF-α的蛋白水平表达明显增高,分别于13-48小时、24小时内以及13-48小时到达高峰,细胞凋亡于13-48小时达到高峰,且与NF-κB的活化关系密切； 2、NF-κB的活化、IL-1β、TNF-α的表达以及细胞凋亡存在着与动物模型实验相似的时间变化规律； 3、通过干预NF-κB活化的方法治疗人类脑出血,减轻炎性反应,减少细胞凋亡,进而改善患者的预后是可行的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.34

【参考文献】