大鼠增殖抑制基因对大鼠胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究
发布时间：2018-03-06 13:51
本文选题：神经胶质瘤 切入点：腺病毒 出处：《宁夏医科大学》2014年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的： 研究腺病毒介导的大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG)在大鼠胶质瘤细胞(C6)中的表达及其对大鼠胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其作用的机制。 方法： 1、体外培养大鼠胶质瘤细胞(C6细胞)，用携带有rHSG基因的重组腺病毒载体(Adv-rHSG-GFP)转染C6细胞。根据MOI将细胞分为：A组MOI=0、B组MOI=10、C组MOI=50、D组MOI=80、E组MOI=100，，转染Adv-rHSG-GFP24h后分别收集每组细胞，采用Western Blot和免疫细胞化学法检测rHSG蛋白的表达，并通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜观察GFP阳性表达来评价重组腺病毒载体的转染效率。用MOI为100的Adv-rHSG-GFP转染C6细胞不同时间后(12h,24h,36h,48h)，同法收集细胞并检测rHSG蛋白的表达及评价重组腺病毒载体的转染效率。 2、C6细胞分为未转染组、Adv-GFP转染组和Adv-rHSG-GFP转染组，采用Western blot法和免疫细胞化学法检测rHSG蛋白的表达；使用流式细胞仪分析细胞周期，并结合MTT、细胞计数法和平板克隆形成实验观察rHSG对细胞增殖的影响；应用Western blot法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和细胞周期调控蛋白p27Kip1、p21Cip1的蛋白表达变化； 3、通过Hoechst33342/PI双染法和彗星实验观察C6细胞凋亡的形态学特征以及rHSG对细胞凋亡的影响；采用Western blot法检测过表达rHSG后PARP和cleaved caspase-3蛋白水平变化以及检测过表达rHSG对胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor，IGF-1)诱导的PI3K/Akt和MAPK信号通路的影响。 结果： 1、Adv-rHSG-GFP转染C6细胞24h后，rHSG蛋白的相对表达量和绿色荧光蛋白表达随MOI值的增高而增多；用MOI为100的Adv-rHSG-GFP转染C6细胞后，12h即可观察到绿色荧光蛋白的表达，且在24h内随时间的变化而增高，在24-36h绿色荧光蛋白表达无变化，48h有所降低(P㩳0.01)；rHSG蛋白相对表达量在12-48h内随时间的变化而增高，于48h达到最大值(P㩳0.01)。 2、Adv-rHSG-GFP转染组C6细胞中：rHSG蛋白的能够高效表达且相对表达量均明显高于未转染组和Adv-GFP转染组(P0.01)；流式细胞仪分析结果表明细胞周期被阻滞在G0/G1期，且MTT、细胞计数和平板克隆形成实验显示大鼠胶质瘤细胞增殖受到明显抑制(P0.01)；周期调控蛋白p27Kip1、p21Cip1表达升高，PCNA表达降低。 3、通过Hoechst33342/PI双染法和彗星实验观察到rHSG可以促进C6细胞凋亡和DNA损伤；Western blot法检测结果显示过表达rHSG后Full-length PARP于24h、72h和96h表达量明显升高(P0.01)，而在48h明显降低(P0.01)；cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白表达量明显升高(P0.01)，并能够显著抑制IGF-1诱导的Akt和Erk1/2蛋白活化，且rHSG对p-Erk1/2的抑制强于对p-Akt的抑制。 结论： 1、携带有rHSG基因的重组腺病毒载体能够有效转染C6细胞，且在MOI值为100，24h时有最高转染效率。 2、rHSG基因过表达能够抑制C6细胞的增殖，其机制可能是通过参与细胞周期调节发挥作用。 3、rHSG基因过表达能够促进C6细胞的凋亡，其机制可能是通过PI3K/Akt和MAPK信号通路发挥作用，并以MAPK信号通路为主。
[Abstract]:Objective:
To study the expression of adenovirus mediated rat hyperplasia suppressor gene (rHSG) in rat glioma cells (C6) and its effect on proliferation and apoptosis of rat glioma cells, and to explore the mechanism of its action.
Method锛
本文编号：1575097
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