TGF-β1和MGF对家兔骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

发布时间：2018-03-07 19:41

  本文选题：肌卫星细胞　切入点：转化生长因子-β1　出处：《遵义医学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:探讨兔骨骼肌卫星细胞分离提取和培养方法,并观测TGF-β1、MGF在不同浓度和时间对体外培养的兔骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响。方法:1.选取一周焍健康乳兔,采用改良混合酶消化结合差速贴壁法,分离提取骨骼肌卫星细胞(SMSCs),原代培养行Desmin免疫细胞化学法鉴定;2.取生长良好的第三代SMSCs以8x103个/m L的密度接种于96孔板,设对照组、不同浓度梯度的TGF-β1组(0.5、1、2、5、10、20ng/m L)和MGF组(15、30、45、75、100、125ng/m L),加药后各组继续培养6d,显微镜下观察细胞的生长情况,每间隔24h,CCK-8法检测各组的OD值,确定相对最佳作用的TGF-β1和MGF浓度;3.CCK-8法检测相对最佳作用浓度下TGF-β1组、MGF组和TGF-β1+MGF组及对照组的OD值,Real time PCR检测(对照组、TGF-β1组和MGF组)第0、2、4、6天Myf5和Myogenin m RNA水平变化。结果:1.分离提取的家兔细胞经免疫细胞化学Desmin染色呈强阳性表达。2.不同浓度TGF-β1和MGF干预CCK-8检测的OD值(1)TGF-β1组:第4天增殖效果显现,10ng/m L组OD值显著高于对照组及其他浓度组(P0.01);第5天,各浓度实验组OD值均高于对照组(P0.01),其中10ng/m L组OD值显著高于其他各组(P0.01),20ng/m L组OD值显著高于0.5ng/m L、1ng/m L组、2ng/m L组、5ng/m L组(P0.05);第6天,各实验组OD值均高于对照组(P0.01),其中10ng/m L组OD值显著高于其他各组(P0.01),0.5ng/m L组OD值低于1ng/m L组、2ng/m L组(P0.01),1ng/m L组OD值与2ng/m L组无显著差异(P0.05)。确定10ng/m L TGF-β1为相对最佳效应浓度值。(2)MGF组:第2天增殖效应开始显现,各剂量实验组OD值均显著高于对照组(P0.01),100ng/m L组OD值显著高于15ng/m L组、30ng/m L组、45ng/m L组(P0.05);第3、4、5天各组的OD值进一步增高,但整体上升趋势同第2天;第6天,45ng/m L组、75ng/m L组、100ng/m L组、125ng/m L组OD值均显著高于对照组(P0.01),而15ng/m L组、30ng/m L组与对照组比较差异无显著性(P0.05),且其OD值均显著低于45ng/m L组、75ng/m L组、100ng/m L组、125ng/m L组(P0.01),100ng/m L组的OD值均显著高于其余各组(P0.01)。确定100ng/m L的MGF为最佳效应浓度值。(3)相对最佳浓度组:第2天,MGF组(100ng/m L)OD值显著高于对照组(P0.01),而TGF-β1组(10ng/m L)和TGF-β1+MGF组的OD值与对照组比较无显著差异(P0.05);第3天至第6天,TGF-β1组、MGF组的OD值均显著高于对照组(P0.01),同时MGF组的OD值显著高于TGF-β1组的(P0.01),但TGF-β1+MGF组OD值与对照组比较无显著性差异(P0.05)。3.Myf5、Myogenin的m RNA水平对照组、TGF-β1组、MGF组Myf5的m RNA表达量呈先上升后下降的趋势,Myogenin呈低量弱表达后缓慢上升的趋势。TGF-β1组第4天Myf5的m RNA表达量高于第0天(P0.01),虽也高于同期的对照组,但无显著性差异(P0.05);TGF-β1组Myogenin的m RNA表达量在6天的细胞培养期内与同期的对照组比较无显著性差异(P0.05)。MGF组第2天Myf5的m RNA表达量显著高于同期的对照组及TGF-β1组(P0.05),第4天的表达量虽高于同期对照组及TGF-β1组,但也均无显著性差异(P0.05);MGF组Myogenin在第4天、6天的m RNA表达量均显著低于对照组和TGF-β1组(P0.05)。结论:1.采用混合酶消化结合差速贴壁法成功分离提取家兔骨骼肌卫星细胞,实现肌卫星细胞的体外培养和鉴定。2.TGF-β1在0.5~20ng/m L范围内对兔SMSCs有促增殖效应,以10ng/m L时促增殖效果相对最佳,但对兔SMSCs抑制分化的作用较弱。3.MGF在15~125ng/m L范围内对兔SMSCs有促增殖效应,以100ng/m L时促增殖效果相对最佳,且该浓度对兔SMSCs有较强的抑制分化效应。4.相对最佳浓度TGF-β1和MGF作用于兔SMSCs时,MGF促增殖效果强于TGF-β1,但二者联用时并无明显促增殖效应。
[Abstract]:Objective: To investigate the isolation and culture method of rabbit skeletal muscle satellite cells, and observed the TGF- beta 1, MGF on cultured in different concentration and time of cell proliferation and differentiation of rabbit skeletal muscle satellite. Method: 1. choose a week Di health rabbit, using a modified hybrid enzyme digestion combined with differential adhesion method the extraction, separation of skeletal muscle satellite cells (SMSCs), cultured for Desmin immunocytochemistry identification; 2. good growth of the third generation of SMSCs /m L with 8x103 were inoculated in 96 well plate, control group, different concentration gradient of TGF- beta 1 group (0.5,1,2,5,10,20ng/m L) and MGF group (15,30,45,75100125ng/m L), were cultured for 6D after treatment, cell growth was observed under a microscope, every 24h, OD value was detected by CCK-8 method, to determine the relative best effect of TGF- beta 1 and MGF concentration; 3.CCK-8 method was used to detect the phase of the optimal concentration of TGF- beta 1 group, MGF 缁勫拰TGF-尾1+MGF缁勫強瀵圭収缁勭殑OD鍊，

本文编号：1580709