星形胶质细胞介导的腺苷信号在持续惊厥后癫痫形成中的作用研究

发布时间：2018-03-09 18:08

  本文选题：惊厥持续状态　切入点：海马　出处：《重庆医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分持续惊厥后星形胶质细胞活化与神经元损伤的动态观察 目的：观察惊厥持续状态后大鼠海马星形胶质细胞与神经元的动态变化。 方法：以成年SD大鼠为研究对象，建立氯化锂-匹罗卡品诱导60minSC模型，在SC后1天至8周的4个时间点上采集大鼠海马组织，采用免疫荧光双重标记GFAP/NeuN，观察SC后大鼠海马星形胶质细胞与神经元的动态变化；采用RT-qPCR与Western Blot检测GFAP的表达。 结果：（1）以NeuN标记神经元发现，SC后1天大鼠海马出现以CA1区、CA3区为著的神经元死亡，持续至SC后8周，并可见神经元丢失遗留空穴；（2）GFAP标记的星形胶质细胞于SC后5天出现数目增多（P0.05），持续至SC后8周（P0.01），并可见细胞胞体肥大，，突起增多增粗，在神经元丢失区域形成胶质疤痕；（3）GFAP-mRNA的表达水平在SC后1天即有升高，在SC后5天、SC后4周、SC后8周均显著高于正常对照组（P0.01），于SC后4周达高峰；（4）SC后5天GFAP的蛋白表达水平开始升高，SC后4周达高峰，SC后8周仍高于正常对照组（P0.01），与GFAP-mRNA的表达基本一致。 结论：SC后大鼠海马出现选择性神经元坏死及反应性星形胶质细胞活化，一直持续至慢性癫痫晚期；胶质活化开始于SC后潜伏期，早于慢性癫痫期。 第二部分：星形胶质细胞介导腺苷信号通路在持续惊厥后的表达变化 目的：探讨星形胶质细胞介导腺苷信号通路在癫痫形成中的动态变化。 方法：以成年SD大鼠为研究对象，建立氯化锂-匹罗卡品诱导60minSC模型，在SC后1天至8周的4个时间点上采集大鼠海马组织，采用高效液相色谱法检测海马腺苷含量的动态变化；采用免疫荧光双重标记ADK/GFAP、ADK/NeuN，检测SC后大鼠海马星形胶质细胞与神经元中ADK的表达；采用RT-qPCR与Western Blot检测ADK的表达；采用Western Blot检测腺苷受体A1R、A2aR、A2bR、A3R的表达。 结果：（1）与正常对照组相比，SC后1天海马腺苷含量升高并达高峰（P0.01），在SC后5天开始下降，SC后4周、SC后8周明显回落，SC后8周显著低于正常对照组（P0.01）；（2）SC后5天ADK/GFAP阳性细胞数开始增多（P0.01），于SC后4周达高峰，并持续至SC后8周， ADK在星形胶质细胞胞浆中表达明显；SC后5天ADK/NeuN阳性细胞数目开始增多，于SC后8周达高峰（P0.01），主要分布于海马CA1区、CA3区，ADK在神经元胞核内表达明显；（3）海马ADK-mRNA与ADK蛋白表达水平基本一致，在SC后5天开始升高（P0.01），于SC后4周达高峰，一直持续至SC后8周；（4）腺苷受体的表达呈多样性，A1R呈双向表达，SC后1天较正常对照组明显升高（P0.01），SC后5天开始下降，并延续到SC后4周、SC后8周；A2aR的表达在SC后1天开始升高，于SC后4周达高峰，一直持续至SC后8周（P0.01）；A2bR、A3R表达在SC后1天均开始下降，低于正常对照组（P0.01），一直持续至SC后8周。 结论：SC后大鼠海马腺苷含量在急性期急剧升高，但未能维持至慢性癫痫期，可能与ADK的表达逐渐增强有关；腺苷及腺苷受体A1R/A2aR表达失衡，可能削弱腺苷的内源性抗惊厥作用，促进癫痫发生。 第三部分:星形胶质细胞介导的腺苷信号与惊厥易感性的实验研究 目的：探讨星形胶质细胞介导的腺苷信号通路在癫痫形成中的作用及可能机制。 方法：采用膜片钳记录技术，以无镁诱导海马脑片放电为模型，的影响；采用星形胶质细胞—神经元共培养体系，免疫荧光双重标记ADK/GFAP、ADK/NeuN，观察ADK在原代培养神经细胞中的分布和表达特点；采用膜片钳记录技术，以无镁诱导神经元放电为模型，检测ADK抑制剂、A1R拮抗剂、A2aR拮抗剂对神经元兴奋性的影响。 结果：（1）与正常人工脑脊液海马脑片相比，无镁人工脑脊液可诱导海马脑片爆发样的自发性放电，ADK抑制剂、腺苷A2aR拮抗剂可引起无镁诱导海马脑片的爆发性放电的潜伏期延长，放电持续时间缩短（P0.01），A1R拮抗剂未能改变无镁人工脑脊液海马脑片的放电特性（P0.05）；（2）体外分离培养的海马神经元与星形胶质细胞均有ADK表达，ADK在神经元中呈核型分布，在星形胶质细胞中呈胞浆型与核型共同分布；（3）与正常细胞外液神经元的动作电位相比，无镁细胞外液可诱导神经元异常放电，作用于星形胶质细胞的ADK抑制剂使神经元异常放电频率明显下降（P0.01），而单纯作用于神经元的ADK抑制剂对神经元异常放电频率无明显改变（P0.05）；（4）A2aR拮抗剂可降低神经元异常放电频率(P0.01），而A1R拮抗剂未能减少神经元异常放电频率（P0.05）。 结论：ADK通过星形胶质细胞调节腺苷代谢，ADK抑制剂可降低神经元的兴奋性，提高惊厥的阈值；腺苷抗惊厥特性可能主要由A1R介导，而在A2aR水平的调控也有助于调节神经兴奋性。
[Abstract]:The dynamic observation of astrocyte activation and neuron damage in the first part after persistent convulsion
Objective: To observe the dynamic changes of astrocytes and neurons in the hippocampus of rats after the persistent state of convulsion.
Methods: adult SD rats as the research object, the establishment of lithium pilocarpine induced 60minSC model rat hippocampus, collected at 4 time points SC after 1 and 8 weeks, using double immunofluorescent labeling of GFAP/NeuN, the dynamic changes of rat hippocampal astrocytes and neurons were observed by SC; expression RT-qPCR Western and Blot GFAP detection.
Results: (1) using NeuN labeled neurons, 1 days after SC in the hippocampus of rats in CA1 District, CA3 district for the death of neurons, until 8 weeks after SC, neuronal loss and visible left hole; (2) GFAP labeled astrocytes in SC occurred 5 days after the increase of the number of (P0.05), until 8 weeks after SC (P0.01), and visible cell body hypertrophy, prominences thickening in regional neuronal loss formation of glial scar; (3) the expression level of GFAP-mRNA in SC after 1 days increased in SC after 5 days, 4 weeks after SC, SC after 8 weeks significantly higher than the normal control group (P0.01), 4 weeks after SC and reached the peak 5 days; (4) the protein expression level of GFAP began to increase after SC, the peak of up to 4 weeks after SC, SC after 8 weeks is still higher than the normal control group (P0.01), consistent with the expression of GFAP-mRNA.
Conclusion: after SC, the selective neuron necrosis and reactive astrocyte activation in the hippocampus continue to reach the late stage of chronic epilepsy in rats. The activation of glial cells starts after SC, which is earlier than the chronic epilepsy stage.
The second part: the changes in the expression of adenosine signaling pathway mediated by astrocytes after persistent convulsion
Objective: To investigate the dynamic changes of astrocyte mediated adenosine signal pathway in the formation of epilepsy.
Methods: adult SD rats as the research object, the establishment of lithium pilocarpine induced 60minSC model rat hippocampus, collected at 4 time points SC after 1 and 8 weeks, the dynamic changes of the HPLC method for the determination of adenosine in hippocampus; using double immunofluorescence labeling of ADK/GFAP and ADK/NeuN. The expression of SC after rat hippocampal astrocytes and neurons in ADK; the expression of RT-qPCR and Western Blot detection of ADK by Western Blot; detection of adenosine receptor A1R, A2aR, A2bR, A3R expression.
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本文编号：1589659