miR-320a异常减少在胶质瘤发生发展中的作用及其机制研究

发布时间：2018-03-13 01:04

  本文选题：胶质瘤　切入点：葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1　出处：《天津医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【目的】miR-320a是多种常见恶性肿瘤的抑瘤miRNA,其表达异常减少与这些肿瘤的发生、发展密切相关,但该miRNA在胶质瘤中的表达情况如何,其与胶质瘤的良恶性级别及患者预后有何关系尚不清楚。生物信息学预测显示葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1基因SND1及β-连环蛋白基因CTNNB1均是miR-320a的潜在靶基因,且其编码蛋白的表达水平均随胶质瘤良恶性级别的升高而升高,但在胶质瘤细胞中两种基因是否是miR-320a的天然靶基因,两种蛋白的表达水平与miR-320a的关系如何,尚需观察与证实。此外,miR-320a对胶质瘤的增殖和迁移侵袭有何影响,SND1和β-catenin在其中发挥了何种作用,其下游相关效应通路如何亦需进一步探讨。本研究以不同级别人胶质瘤标本和人胶质母细胞瘤细胞系为研究对象,对上述问题进行深入系统的研究。【方法】1.采用组织微阵列和锁定寡核苷酸探针原位杂交技术,在120例不同级别胶质瘤组织标本及20例对照脑组织中检测miR-320a的阳性标记指数(LI%),分析不同级别胶质瘤miR-320a的表达变化,结合临床随访资料,通过KaplanMeiers生存分析探讨其表达水平与患者生存期之间的关系。采用茎环qRT-PCR检测、比较永生化胶质细胞系和7种胶质母细胞瘤(GBM)细胞系miR-320a的表达水平。2.利用miR-320a mimics转染人GBM细胞系U87MG及U251,利用茎环qRT-PCR验证瞬时转染效率,采用CCK8、体外克隆形成实验、transwell体外迁移侵袭实验以及细胞划痕实验观察外源性补充mi R-320a对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。3.采用生物信息学分析预测miR-320a的潜在靶点,通过荧光素酶实验在U87MG及U251中验证SND1和β-catenin的mRNA是否为miR-320a的靶mRNA。采用qRT-PCR及Western blot技术检测转染miR-320a后上述GBM细胞系SND1和β-catenin mRNA及蛋白表达水平的变化,探索miR-320a敲低SND1和β-catenin表达的分子机制。4.采用组织微阵列和免疫组织化学方法,检测同批次胶质瘤及对照脑组织标本中ki-67以及snd1和β-catenin的蛋白表达水平,分析各检测指标与胶质瘤良恶性级别之间的关系以及其与mir-320a含量之间的相关性,寻找mir-320a调节snd1和β-catenin表达的组织学证据。结合临床随访资料,通过kaplan-meiers生存分析探讨snd1和β-catenin表达水平与患者生存期之间的关系,并用单因素及多因素cox比例风险回归模型筛选胶质瘤患者预后的独立预测因子。5.利用cck8实验、edu细胞增殖实验和流式细胞术(fcm)检测mir-320a转染对u87mg及u251细胞系细胞增殖和细胞周期分布的影响;在此基础上,通过转染snd1或β-catenin真核表达质粒提高mir-320a转染细胞中相应蛋白的表达水平,观察其是否可逆转mir-320a对细胞增殖和细胞周期分布的影响。利用westernblot检测上述各组细胞p21waf1和cyclind1的表达水平,以明确mir-320a抑制gbm细胞增殖的效应通路和分子机制。6.利用transwell体外迁移侵袭实验观察mir-320a转染对gbm细胞系迁移和侵袭的影响以及补充外源性snd1或β-catenin是否能逆转mir-320a对迁移侵袭的抑制作用。通过明胶酶谱分析和酪蛋白酶谱分析检测mir-320a转染后细胞培养基中mmp2和mmp7基质金属蛋白酶活性的变化,通过qrt-pcr检测转染mir-320a对细胞内mmp2和mmp7mrna含量的影响。通过westernblot检测转染mir-320a对gbm细胞系mmp2和mmp7蛋白表达的影响以及补充外源性snd1或β-catenin能否逆转该影响,以明确mir-320a抑制gbm细胞迁移侵袭的效应通路和分子机制。7.利用重组慢病毒感染建立稳定敲低snd1的u87mg及u251亚细胞系及对照亚细胞系,通过transwell体外迁移侵袭实验进一步验证snd1对gbm细胞迁移侵袭的影响。采用qrt-pcr检测各亚细胞系总smad2(t-smad2)、smad4以及mmp2mrna含量。利用westernblot检测u87mg各亚细胞系总t-smad2、p-smad2、smad4以及mmp2的蛋白水平以及外源性tgfβ1处理对其表达的影响,以探讨snd1调节mmp2表达的分子机制。【结果】1.原位杂交结果显示,各胶质瘤组mir-320a表达含量均明显低于非肿瘤对照脑组织,并随肿瘤良恶性级别的升高而相应降低,各胶质组与对照组之间以及各级别胶质瘤组间的差异均有统计学意义(p0.001)。kaplan-meier生存分析显示,在各级别组及所有120例胶质瘤患者中高表达mir-320a患者的无进展生存时间(dfs)和总生存时间(os)均明显高于低表达mir-320a患者,差异有统计学意义(p0.0001)。茎环qrt-pcr检测结果显示,永生化胶质细胞uc2中mir-320a水平明显高于其它各胶质瘤细胞系,差异有统计学意义(p0.01~0.001)。2.cck8实验和体外克隆形成实验结果显示,mir-320a转染可明显降低u87mg及u251细胞的增殖活性和u251细胞的克隆形成效率;transwell体外迁移侵袭实验结果显示,mir-320a转染可明显降低两种gbm细胞的迁移和侵袭能力。3.生物信息学分析显示,snd1和ctnnb1基因均为mir-320a的潜在靶基因。荧光素酶实验结果显示,含mir-320a靶序列的野生型snd1或β-cateninmrna的3’utr均可介导mir-320a对荧光素酶报告基因的沉默作用,而删除mir-320a靶序列的突变型3’utr不能介导上述沉默作用。qrt-pcr和westernblot检测结果显示,mir-320a转染组snd1和β-catenin的mrna及蛋白水平均明显低于无义对照序列转染组,差异有显著性(p0.05~0.001)。以上结果证实在胶质瘤细胞中snd1和ctnnb1基因均为mir-320a的靶基因,mir-320a通过与snd1和β-cateninmrna3’utr上的靶序列结合诱导mrna的降解并抑制其编码蛋白的表达。4.免疫组织化学检测结果显示,各胶质瘤组snd1、β-catenin及ki-67li%均明显高于非肿瘤对照脑组织,并均随肿瘤的良恶性级别的升高而升高,各胶质瘤组与对照组间以及各级别胶质瘤组间差异均有统计学意义(p0.001)。pearson相关分析显示,mir-320ali%分别与ki-67、snd1及β-cateninli%呈显著负相关性(ki-67,r=-0.976;snd1,r=-0.981;β-catenin,r=-0.975),而ki-67li%分别与snd1和β-cateninli%呈显著正相关性(snd1,r=0.984;β-catenin,r=0.975)。生存分析证实,在各级别组和所有120例胶质瘤患者中,snd1及β-catenin高表达组的dfs和os均明显低于snd1及β-catenin低表达组,差异有统计学意义(p0.0001)。cox回归分析显示,mir-320ali%为胶质瘤患者dfs和os的保护性因素,而snd1和β-cateninli%为其风险因素,其中mir-320a与snd1li%可作为胶质瘤患者预后的独立预测因子。5.cck8、edu检测结果显示,mir-320a转染可明显降低u87mg及u251细胞的增殖活性,而通过真核表达质粒转染提高细胞内snd1和β-catenin表达水平可有效逆转mir-320a的增殖抑制作用。fcm检测结果显示,mir-320a转染使g0/g1期的细胞比例明显高于无义对照序列转染组;而提高snd1和β-catenin表达水平则可逆转mir-320a对细胞周期分布的影响。westernblot检测结果显示,mir-320a可提高gbm细胞内p21waf1的表达水平并降低cyclind1的表达水平,且上述调控作用可分别被snd1和β-catenin真核表达质粒转染所逆转。以上结果证实mir-320a可分别通过敲低snd1和β-catenin上调p21waf1和下调cyclind1的表达,从而诱导gbm细胞的g1期阻滞。6.体外迁移侵袭实验结果显示,mir-320a转染组细胞的迁移侵袭能力明显低于无义对照序列转染组,而提高细胞内snd1或β-catenin的表达水平可有效逆转mir-320a对迁移侵袭的抑制作用。明胶和酪蛋白酶谱分析结果显示,mir-320a转染可降低u87mg与u251细胞培养基中mmp2和mmp7的活性。qrt-pcr检测结果显示,mir-320a转染组细胞内mmp2和mmp7mrna含量显著低于对照转染组。westernblot检测结果显示,mir-320a转染可下调gbm细胞mmp2和mmp7的表达,而上述调节作用可分别被snd1和β-catenin真核表达质粒转染所逆转。以上结果证实,mir-320a可分别通过敲低snd1和β-catenin抑制mmp2和mmp7的表达,降低细胞的迁移侵袭能力。7.transwell体外迁移侵袭实验结果证实敲低snd1可有效抑制gbm细胞系的迁移侵袭能力。qrt-pcr与westernblot检测结果显示,在稳定敲低snd1的gbm亚细胞系,其smad2、smad4和mmp2mrna表达水平以及t-smad2、p-smad2、smad4和mmp2蛋白水平均明显低于对照亚细胞系,证实在人胶质瘤细胞中敲低snd1可抑制tgfβ通路关键因子和mmp2的表达。经外源性tgfβ1刺激后,对照亚细胞系t-smad2、p-smad2、smad4和mmp2蛋白水平均有明显提高,而稳定敲低snd1的gbm亚细胞系除p-smad2及mmp2的含量略有上升外,其余蛋白含量无明显改变,证实敲低snd1可降低gbm细胞tgfβ通路的活性及其对外源性tgfβ的反应性,消弱其诱导mmp2表达的能力。【结论】1.人胶质瘤组织和胶质母细胞瘤细胞系中普遍存在mi R-320a表达异常降低,miR-320a表达水平随胶质瘤良恶性级别升高而相应降低,可作为辅助胶质瘤良恶性分级的参考指标。2.miR-320a可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,其表达异常降低是GBM细胞快速增殖和活跃迁移侵袭的重要机制,在胶质瘤发生发展中起重要作用。3.在胶质瘤细胞中SND1和β-catenin mRNA均是miR-320a的靶mRNA,miR-320a可以其种子序列与SND1和β-catenin mRNA 3’UTR上的靶序列结合,诱导二者降解,并在转录后水平抑制SND1和β-catenin蛋白的表达。4.在人胶质瘤组织中,SND1和β-catenin表达水平亦随胶质瘤良恶性程度的升高而增加,其表达水平与miR-320a呈显著负相关,说明胶质瘤细胞中miR-320a表达减少是SND1和β-catenin过表达的重要原因。三者的表达水平均与患者的DFS和OS相关,其中miR-320a和SND1 LI%是胶质瘤患者预后的独立预测因子。5.miR-320a通过敲低SND1上调p21WAF1的表达水平,通过敲低β-catenin下调cyclin D1的表达水平,从而阻遏GBM细胞G1/S期过渡、诱导细胞的G1期阻滞、抑制细胞的增殖。6.miR-320a分别通过敲低SND1和β-catenin抑制MMP2和MMP7的表达,从而起到抑制胶质瘤细胞迁移侵袭的作用。7.敲低SND1可抑制TGFβ通路关键因子的表达,降低GBM细胞TGFβ通路的活性及其对外源性TGFβ刺激的反应性,消弱其上调MMP2表达的能力,这可能是miR-320a通过敲低SND1抑制MMP2表达的重要机制。8.miR-320a是胶质瘤的多功能抑瘤因子,其可通过多靶点多通路抑制胶质瘤的增殖和迁移侵袭。上述研究成果为探索胶质瘤发生发展的分子机制提供了重要线索,为恶性胶质瘤基因干预和分子靶向治疗新策略的制定奠定了理论基础并提供了丰富、可靠的实验数据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 徐俊杰;于洪泉;国巍;赵伟;金宏;温娜;齐玲;;西兰花多肽对大鼠C6胶质瘤细胞生长的影响[J];中风与神经疾病杂志;2012年11期

2 徐俊杰;于洪泉;赵伟;金宏;温娜;齐玲;刘兴吉;;西兰花多肽对C6胶质瘤细胞的诱导凋亡作用[J];吉林大学学报(医学版);2013年01期

3 仝海波,江澄川,唐镇生,金一尊;胶质瘤细胞化学增敏作用实验研究[J];山西临床医药;2000年07期

4 李嗍,王枫,缪珊,骆文静;过量锌对鼠胶质瘤细胞体外生长的影响[J];解放军预防医学杂志;2001年04期

5 梁一鸣,郭国庆,郑少俊,沈伟哉;胶质瘤血管内皮生长因子表达的调节[J];临床与实验病理学杂志;2001年02期

6 曲元明,韩韬,李桂林,王成伟;血管内皮细胞生长因子抗体对胶质瘤生长的影响[J];山东医科大学学报;2001年02期

7 黄强,董军;胶质瘤的分子外科治疗[J];中国微侵袭神经外科杂志;2001年04期

8 叶明,周岱,周幽心,王玮,傅建新,黄煜伦;血管内皮生长因子在胶质瘤中的表达[J];肿瘤;2002年06期

9 顾宇翔,陈衔城,王宇倩;胶质瘤对亲细胞非均质分子脂质和几种药物敏感性的比较[J];复旦学报(医学版);2003年02期

10 王成伟 ,刘福生 ,曲元明 ,李桂林;血管内皮生长因子抗体抑制胶质瘤生长的实验研究[J];中华神经外科杂志;2003年01期

相关会议论文 前10条

1 李飞;李梅;卢佳友;朱刚;林江凯;孟辉;吴南;陈志;冯华;;脂质微区干扰剂甲基-β-环糊精影响C6胶质瘤细胞侵袭和迁移的体外实验研究[A];中国医师协会神经外科医师分会第四届全国代表大会论文汇编[C];2009年

2 吴安华;王运杰;Ohlfest JR;Wei Chen;Low WC;;胶质瘤的生物治疗-从实验室到临床[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

3 徐宏;韩杨云;孙中书;李新军;;与胶质瘤代谢通路相关的候选基因筛选[A];中华医学会神经外科学分会第九次学术会议论文汇编[C];2010年

4 潘冬生;;多基因修饰胶质瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应[A];中国医师协会神经外科医师分会第六届全国代表大会论文汇编[C];2011年

5 俞文华;车志豪;张祖勇;许培源;陆镛民;傅林;朱强;陈锋;杜权;;骨桥蛋白在胶质瘤细胞中的表达及其信号传导途径[A];2005年浙江省神经外科学术会议论文汇编[C];2005年

6 张震;徐克;;低强度超声诱导C6胶质瘤细胞凋亡的体外实验研究[A];中华医学会第十三次全国超声医学学术会议论文汇编[C];2013年

7 蒋伟峰;高方友;尹浩;;白细胞介素-17及其受体在胶质瘤中的表达及临床意义[A];2013年贵州省神经外科年会论文集[C];2013年

8 徐庆生;张小兵;周永庆;;胶质瘤干细胞及其放疗敏感性[A];2011年浙江省神经外科学学术年会论文汇编[C];2011年

9 杨孔宾;赵世光;刘炳学;陈晓丰;戴钦舜;;K~+通道阻断剂四乙胺对大鼠胶质瘤细胞的增殖和凋亡影响[A];中国医师协会神经外科医师分会第四届全国代表大会论文汇编[C];2009年

10 黄强;;胶质瘤生成细胞研究[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

相关重要报纸文章 前5条

1 衣晓峰　冯宇曦;中药三氧化二砷有望成为治疗胶质瘤新药[N];中国医药报;2011年

2 记者 匡远深;让胶质瘤干细胞不再“繁殖”[N];健康报;2011年

3 张献怀　张文;瘤区埋雷 持续杀伤[N];健康报;2007年

4 白毅;人脑胶质瘤基础与应用研究喜结“九大硕果”[N];中国医药报;2006年

5 王德江；刘藏；王贵怀；曹勇；王新生；肖新如;交流最新进展 提高诊治水平[N];中国医药报;2005年

相关博士学位论文 前10条

1 董军;CUL4B在神经胶质细胞瘤中的作用研究[D];山东大学;2015年

2 张睿;循环miR-221/222在胶质瘤诊断与预后中的价值与基于CED的中枢神经系统给药新方法的研究[D];山东大学;2015年

3 许森林;ALDH1A1在胶质瘤侵袭和结直肠癌转移中的作用和机制[D];第三军医大学;2015年

4 王啸;靶向嵌段共聚物胶束在胶质瘤磁共振成像、药物输送及治疗的应用[D];安徽医科大学;2015年

5 廖红展;锌指转录因子SNAI2在miR-203的影响下通过上皮间质转化参与胶质瘤耐药机制的调节[D];南方医科大学;2015年

6 潘俊;IRG1促进胶质瘤增殖的作用机制及临床意义[D];南方医科大学;2015年

7 郑传宜;胶质瘤中GLUT3基因异常表达的意义及其相关调控机制[D];南方医科大学;2015年

8 徐红超;氩氦冷冻消融联合GM-CSF治疗胶质瘤小鼠的疗效及其对小鼠脾脏树突状细胞免疫功能影响[D];南方医科大学;2015年

9 黄素宁;TNFRSF6B在胶质瘤中的表达及对胶质瘤细胞增殖及凋亡的作用研究[D];南方医科大学;2015年

10 熊伟;GBE1在人脑胶质细胞瘤中的表达及干预实验研究[D];第四军医大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 张大庆;单核细胞趋化蛋白-1在骨髓间充质干细胞向胶质瘤细胞趋化中的作用研究[D];大连医科大学;2012年

2 张静文;T细胞过继免疫治疗小鼠脑胶质瘤原位模型的研究[D];河北医科大学;2015年

3 洪宇;胶质瘤瘤周水肿、病理级别、Ki-67表达三者相关性研究[D];石河子大学;2015年

4 姬云翔;磷酸化Cx43蛋白在人胶质瘤细胞中表达及其与肿瘤细胞增殖相关性研究[D];石河子大学;2015年

5 朱峰;OPN的异常表达与胶质瘤的相关性研究[D];河北医科大学;2015年

6 刘兵;SENP1表达水平对人脑胶质瘤发生发展的作用机制及其相关性[D];河北医科大学;2015年

7 李文华;Slit2/Robo1在人脑胶质瘤中的表达及临床意义[D];河北医科大学;2015年

8 杨睿;组蛋白去乙酰化酶HDAC9在胶质瘤细胞增殖中的作用及机制研究[D];西南大学;2015年

9 李鹏存;胶质瘤患者血浆中microRNAs的异常表达及临床意义[D];天津医科大学;2013年

10 梁英;三株海洋细菌抗胶质瘤活性成分的研究[D];浙江大学;2016年

，

本文编号：1604098