TUBB3在癫痫中的作用和机制研究

发布时间：2018-03-14 05:38

  本文选题：TUBB3　切入点：颞叶癫痫　出处：《重庆医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分TUBB3在难治性癫痫患者及动物模型中的表达目的:检测TUBB3在难治性癫痫患者及两种慢性癫痫大鼠模型脑组织中的表达情况。方法:1.从课楲组建立的由300多例难治性TLE患者术后脑组织组成的脑库中随机抽取癫痫脑组织标本(实验组)30例,非癫痫脑外伤患者脑组织(颞叶皮质)标本作为对照组10例。2.成年雄性SD大鼠(体重220±20g,7-8周龄),氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导癫痫持续状态(SE),构建SE后慢性TLE模型,分为有自发性反复癫痫发作组(SRS,6w,n=8)和无自发性反复癫痫发作组(non-SRS,6w,n=8)。3.构建戊四氮(PTZ)慢性点燃大鼠模型,分为点燃成功组(n=8)和未点燃成功组(n=8)。4.用免疫印迹方法检测TUBB3表达情况,免疫荧光检测TUBB3表达部位。结果:1.难治性TLE患者术后脑组织及对照脑组织中均有TUBB3表达,且TUBB3在癫痫患者术后脑组织中表达较对照组显著增高(★p0.05)。2.在氯化锂-匹罗卡品诱导的慢性癫痫大鼠模型中,有自发性发作的大鼠皮质和海马tubb3表达水平均较无自发性发作组明显增高(★★★p0.001,#p0.05);ptz慢性点燃模型中,点燃成功组大鼠皮质和海马tubb3表达水平均较未点燃组显著增高(★p0.05,##p0.01)。3.癫痫患者脑组织中免疫荧光显示tubb3免疫反应阳性细胞有较长突起,主要在神经元胞质和轴突初段表达,且与抑制性神经元标记物(gad67)和成熟的抑制性突触标记物(gephyrin)共表达,与兴奋性突触标记物(psd95)无共表达;并在慢性癫痫大鼠模型脑组织中得到验证。结论:难治性tle患者和两种慢性癫痫大鼠模型脑组织中tubb3表达均明显增加,且tubb3与抑制性突触共表达,提示tubb3可能参与了癫痫的发生发展。第二部分tubb3对两种癫痫动物模型行为学的影响目的:为进一步探讨tubb3在癫痫发生发展中的作用,我们构建了tubb3-shrna和tubb3过表达基因的腺相关病毒(aav)载体,通过海马立体定位注射改变大鼠海马tubb3表达,观察tubb3对ptz慢性点燃模型和匹罗卡品慢性癫痫模型行为学的影响。方法:1.构建携带有tubb3-shrna和tubb3过表达基因的腺相关病毒载体。2.成年雄性sd大鼠随机分为三组:海马立体定位注射腺相关病毒空载体组(aav-gfp);腺相关病毒tubb3-shrna组(aav-tubb3-shrna);腺相关病毒tubb3过表达组(aav-tubb3)。3.分别用免疫荧光、免疫印迹技术检测转染效率。4.ptz慢性点燃模型行为学观察:在沉默tubb3和过表达tubb3的癫痫模型中,我们利用阈下剂量ptz,每隔48h进行1次,观察点燃过程中各时间点平均发作分级。5.氯化锂-匹罗卡品癫痫模型行为学观察:在沉默tubb3和过表达tubb3的癫痫模型中,造模后持续视频监测大鼠srs情况。统计srs次数和用racine评分评估发作的严重程度。结果:1.aav-tubb3-shrna、aav-tubb3和aav-gfp海马立体定位注射后,免疫荧光结果显示海马ca1和齿状回均有gfp阳性表达。免疫印迹结果显示,与相应时间点对照组相比,tubb3-shrna组od值在病毒注射后第3周和第9周显著降低(★★p0.01),tubb3过表达组od值在病毒注射后第3周和第9周显著增加(★★p0.01)。2.ptz慢性点燃过程中,与对照组相比,tubb3-shrna组各时间点平均发作分级显著降低,tubb3过表达组各时间点平均发作分级显著升高(★p0.05,★★p0.01)。3.氯化锂-匹罗卡品诱导的se后慢性期内(3-6w),与对照组相比,tubb3-shrna组自发性发作次数和5级发作比例显著降低,tubb3过表达组自发性发作次数和5级发作比例显著升高(★p0.05,★★p0.01,★★★p0.001)。结论:1.腺相关病毒tubb3-shrna或tubb3过表达海马立体定位注射后可显著改变海马tubb3的表达,转染在注射后3周有效,可持续至9周。2.腺相关病毒介导的海马tubb3-shrna能减轻ptz慢性点燃过程中各时间点平均发作分级,tubb3过表达产生相反的结果。3.腺相关病毒介导的海马tubb3-shrna能减少氯化锂-匹罗卡品诱导的慢性期自发性发作的次数并减轻发作严重程度,tubb3过表达产生相反的结果。第三部分tubb3在癫痫发作中的作用机制目的:探讨tubb3对点燃动物神经元抑制功能的影响及其可能的潜在机制。方法:1.取25只成年雄性清洁级sd大鼠,根据海马内立体定位注射试剂不同分为三组:aav-tubb3-sh组、aav-tubb3组和aav-gfp组。2.三周后构建ptz慢性点燃大鼠模型,取材制作海马脑片。采用全细胞膜片钳技术检测各组海马ca1区锥体神经元抑制性突触后电流(mipsc)和成对脉冲比例(ppr)的变化情况。3.免疫印迹法检测ptz慢性点燃成功后大鼠海马gaba-a受体β2/3的总蛋白和膜蛋白表达情况。4.免疫共沉淀检测PTZ慢性点燃成功后大鼠海马中TUBB3、GABARAP和GABA-A受体β2/3三者相互作用情况。结果:1.全细胞膜片钳技术对CA1区锥体神经元记录结果显示,与对照组相比,TUBB3-shRNA组中m IPSC幅度显著增高(★P0.05);TUBB3过表达产生了相反的效果;mIPSC频率在TUBB3-shRNA组与GFP组之间无显著性差异(P0.05);TUBB3-shRNA组与GFP组相比,PPR无显著性差异(P0.05)。2.免疫印迹结果显示,TUBB3-shRNA组GABA-A受体β2/3膜蛋白/总蛋白比值显著增加(★P0.05),TUBB3过表达组膜蛋白/总蛋白比值明显降低(★P0.05);GABA-A受体总蛋白表达量无显著变化(P0.05);GluR2/3无显著性差异(P0.05)。3.免疫共沉淀结果显示癫痫大鼠海马组织中内源性TUBB3和内源性GABARAP、GABA-A受体三者相互作用。结论:1.癫痫大鼠海马中下调TUBB3能显著增加海马CA1区椎体神经元的mIPSC幅度。2.癫痫状态下,TUBB3能与GABARAP相互作用选择性影响突触后GABA-A受体依赖性抑制性突触后电流。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1

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本文编号：1609835