外周血全基因组miRNAs表达谱作为筛选癫痫生物标志物的研究

发布时间：2018-03-15 03:25

本文选题：癫痫　切入点：miRNA　出处：《青岛大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征,WHO报告全球活动性癫痫平均患病率约4-10‰,在发展中国家这一比例达到6-10‰,目前全世界约有5000万癫痫病人[1],我国大约有900万癫痫患者,每年以40万发病人数递增。癫痫所给予患者及家庭造成负担是沉重的。目前诊断癫痫主要是依据详尽的临床病史、神经查体、脑电图(EEG)、神经影像学、家族史等,但是癫痫是一类发作性疾病,在发作间期患者可以表现为完全正常,而且患者及家属给予的病史往往也不够详尽,所以诊断仍有一定困难,因此寻找早期诊断癫痫的客观、准确、方便检测的特异性生物标志物是一项急需解决的重要问题。micro RNA(mi RNA)是一种单链的、非编码的小分子RNA,近些年来,主要在肿瘤及一些其他疾病中研究,即使在中枢神经系统疾病中,也主要探究人或动物模型的脑组织及脑脊液中mi RNA的表达,而mi RNA在血液中具有非凡的稳定性,且会随着机体生理病理情况的改变而发生变化,所以我们推测mi RNA在癫痫患者外周全血中可能存在差异表达,那将在早期诊断癫痫中成为一种潜在的生物标志物,从而具有重要应用前景。方法:1、初筛:抽取两组对象(病例组50例,对照组50例)的清晨空腹外周血2ml,应用试剂盒PAX-gene Blood mi RNA kit(Qiagen)进行mi RNA的提取,提取过程完全按照试剂盒的操作指南进行。每个样本留取RNA溶液20μL,并将每组分别混合,得到病例组和对照组混合RNA各1ml。将两组混合RNA进行Hiseq2000高通量测序技术分析病例组和对照组全血所有mi RNAs的表达谱。2、复筛:提取病例组50例、对照组50例的单个样本的mi RNA,提取方法同初筛。并用逆转录试剂盒One Step Prime Script mi RNA c DNA Synthesis Kit(Takara,日本)反转录为c DNA。对初筛筛选出的差异性表达mi RNAs进行进一步扩增。3、验证:对复筛中差异性mi RNA在大样本(病例组100例、对照组100例)的单个样本中进行进一步验证。方法同复筛。4、数据统计结果:1、运用高通量测序进行初筛:全血mi RNA高通量测序显示共有200种mi RNA在两组全血中的表达差异具有统计学意义。选取符合标准的mi RNA进行下一步复筛。2、运用q RT-PCR进行复筛:结果显示,let-7f-5p,-130a-3p,-146a-5p,126-5p,novel-mi R-164的表达水平显著上调,mi R-194-5p,-181c-5p的表达水平显著下调。3、运用q RT-PCR进行大样本验证:与对照组对比中,病例组全血let-7f-5p,-130a-3p,-146a-5p,126-5p的表达水平显著上调,与复筛阶段的变化一致;mi R-181c-5p表达水平显著下调,与复筛阶段变化一致。而mi R-194-5p和novel-mir-164在病例组和对照组间的表达差异无统计学意义。因此排除mi R-194-5p和novel-mir-164作为癫痫的生物标志物。考虑临床操作的简便性和经济性,我们认为mi R-126-5p的诊断价值最高,有望成为诊断癫痫的潜在生物标志物。结论:本研究首次对癫痫患者外周全血全基因组mi RNAs谱进行表达分析,并筛选出5种表达变化的mi RNAs:let-7f-5p,-130a-3p,-146a-5p,-126-5p和mi R-181c-5p,尤其是mi R-126-5p,以其较高的灵敏度和特异度,有望成为早期癫痫诊断的生物学标志物。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1

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