Protocadherin11X对神经干细胞增殖和分化的调控作用研究

发布时间：2018-03-17 08:30

本文选题：原钙粘蛋白　切入点：子宫内电转　出处：《南方医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在大脑皮层的发育过程中,皮层神经元是由位于大脑皮层侧脑室表层室管膜区和亚室管膜区的神经干细胞分裂产生的,并沿着暂时存在的放射状胶质细胞的纤维向皮层远端迁移,最后定居于固定细胞层,并最终参与产生结构严整的大脑皮层。从放射状前体细胞,至中间前体细胞,直至最终迁移至皮层板分化产生皮层神经元,这几个阶段是序列产生的,每个阶段都有其特异性的标记物(Pax6, Tbr2, Tbr1等)。已有研究表明成体干细胞的周围,存在着大量具有特定功能的细胞,它们提供了干细胞赖以生存的各种物质基础,对干细胞的自我更新和分化能力具有调控作用。胚胎期室管膜区和亚室管膜区存在大量的神经干细胞,它们周围存在的微环境是否同样对神经干细胞增殖、分化功能发挥调控作用,以及通过何种机制发挥作用,尚未可知。研究发现大脑皮层的神经干细胞干性的维持与周围环境之间可能存在某种联系,因此,研究神经干细胞与周围环境之间发生联系的物质基础,对于深刻理解神经干细胞具有自我更新及分化能力的发生机制具有关键性作用。Anjen Chenn研究小组的实验结果提示,钙粘蛋白可能是神经干细胞与周围环境发生联系的重要物质基础,结合近年来的相关研究发现,无论是果蝇生殖系统的干细胞还是骨髓环境中的造血干细胞,均通过粘附连接的形式与周围环境发生联系。因此,本课题对钙粘蛋白进行深入研究对于了解干细胞干性维持的分子机制具有非常重要的生理意义。钙粘蛋白不仅在干细胞干性维持过程中发挥作用,在一些疾病的发生、发展过程中也扮演了重要的角色。例如,在神经胶质瘤的发生过程中,在肿瘤侵袭转移的过程中以及多种神经精神疾病的发病过程中,钙粘蛋白均与其关系密切。因此,开展对钙粘蛋白的相关研究亦具有非常重要的现实意义。钙粘蛋白是一类存在于细胞粘膜表面介导细胞与细胞、细胞与基质之间相互粘附作用的跨膜糖蛋白,在细胞连接中发挥重要作用,对于胚胎发育的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。钙粘蛋白超家族包括经典钙粘蛋白(Classic cadherin),原钙粘蛋白(Protocadherin, Pcdh),桥粒芯糖蛋白(Desmogleins),桥粒芯胶粘蛋白(Desmocollins)等亚家族,它们在结构方面共享了“钙粘蛋白重复”的胞外钙离子-结合结构域。在钙粘蛋白超家族中,原钙粘蛋白(Pcdh)是最大的亚家族,它的存在决定了细胞之间相互作用的多样性。原钙粘蛋白在胞外区有6-7个串联重复单位,一个一次性跨膜区,胞内区与经典钙粘蛋白和其它钙粘蛋白有一定的相似性。原钙粘蛋白由58个成簇型和13个非簇型的亚型组成,其中簇型原钙粘蛋白根据其胞质区的不同,被分成三个基因族簇,分别为Pcdh-α,p和丫,而非簇型原钙粘蛋白根据其胞外串联重复单位(EC)的数量和胞内的结构特性分为δ型原钙粘蛋白和其它原钙粘蛋白,其中,δ型原钙粘蛋白根据是否具有蛋白磷酸酶结合位点(PPla)又被分为δ1型和δ2型,δ1型含PP1α结合位点,δ2型不含PPla结合位点。 Pcdh11属于Pcdh δ家族中的δ1型,主要表达于脑内,由7个胞外EC结构、1个短的跨膜结构和一个亚型之间长度可变的胞内段组成。Pcdh11分为pcdh11x和pcdh11y两个亚型,分别位于Xq21.3和Yp11.2染色体上。600万年前,染色体Xq21.3通过基因转位至Yp11.2,形成了Protocadherin11X/Y基因对,因此,雌性表达Pcdh11x,雄性表达Pcdh11x和pcdh11y。 Pcdh11x的分子结构研究已然较为透彻,然而对其生理作用的研究仍处于起步阶段。原钙粘蛋白与经典钙粘蛋白有一很大不同,即原钙粘蛋白不仅可介导胞间连接,还可调控其他分子。当其胞内段被移除或被其他小分子所取代时,其本身所具有的调控作用可增强或削弱,表明了原钙粘蛋白分子作用的多样性。已有研究报道指出Pcdh11x与精神分裂症,孤独症,躁郁症或注意力缺失有关,另有一单独案例发现语言缺失与Pcdh11x染色体的某一位点缺失相关。根据上述案例可知Pcdh11x可能与神经系统疾病之间存在紧密的联系。综上所述,Pcdh11x主要表达于神经系统,并发挥重要作用,与神经和精神疾病的发生密切相关,本课题拟从Pcdh11x在脑内的表达分布,对神经干细胞增殖、分化和迁移的影响等多个方面入手,研究Pcdh11x在神经系统中的作用。本研究内容分为两章阐述：第一章Pcdh11x的脑内分布及表达情况分析研究目的 1.研究Pcdh11x在小鼠脑内的分布； 2.研究Pcdh11x的细胞定位； 3.神经系统发育过程中Pcdh11x的表达情况；技术方法 1.Pcdhllx在小鼠脑内表达情况研究利用免疫组化检测成年小鼠脑内Pcdh11x的表达情况,同时利用Pcdh11x的抗体阻断肽检测该抗体的特异性；利用PCR的方法检测Pcdh11x mRNA在小鼠体内的分布表达情况。 2. Pcdh11x在小鼠体内的细胞定位研究利用免疫荧光染色的方法检测Pcdh11x与GFAP和Pcdh11x与NeuN的共标情况；利用瞬时转染pCAG-pcdh11x-GFP和pCAG-GFP质粒至293T细胞系的方法,同时结合Pcdh11x的免疫荧光检测方法,再次确定Pcdh11x抗体的特异性。 3.不同发育时间点Pcdh11x的表达情况研究利用荧光定量PCR的方法检测小鼠胚胎期12天,14天,16天,18天和生后1天,4天和7天不同时间点Pcdh11x在皮层,海马和侧脑室的表达情况。 4. Pcdh11x与神经干细胞相互关系的研究利用免疫荧光检测的手段,检测Pcdh11x与Nestin和Pcdh11x与Sox-2的共标情况；利用PCR的方法检测神经干细胞中Pcdh11x与Nestin和Sox-2的检测情况。 5.统计学分析所有数据均代表三次以上重复实验的结果,使用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理。采用单向方差分析(One-Way ANOVA)等统计方法进行统计分析。数据用均数±标准差(x±SD)表示。P0.050代表差异有统计学意义。研究结果 1. Pcdhllx主要表达于小鼠脑内我们首次用免疫组化的方法对小鼠成年脑内Pcdh11x的分布做了研究,结果表明Pcdh11x主要分布于皮层,下丘脑,纹状体等脑区。同时为了验证Pcdh11x抗体的特异性,我们加入了针对Pcdh11x抗体的阻断肽以阻断Pcdh11x抗体的结合位点,结果表明该组并未检测到Pcdh11x的阳性信号。在本研究中,我们为了检测Pcdh11x在小鼠体内的表达分布情况,还对其mRNA用RT-PCR的方法进行了检测。首先,我们对Pcdh11x在侧脑室,海马,皮层,肾脏,肝脏,心脏等器官组织的分布进行了检测,结果表明,Pcdh11x主要表达于小鼠脑内,在其他组织仅有较少量的分布。接下来,我们对小鼠脑内不同脑区内Pcdh11x的表达情况进行了分析。我们的结果表明Pcdh11x在中脑,皮层,海马,侧脑室,小脑,下丘脑,胼胝体和黑质-纹状体内均有表达。 2. Pcdh11x主要定位于NeuN+细胞,不表达于GFAP+细胞上述Pcdh11x的表达情况提示Pcdh11x主要分布于脑内,接下来我们对Pcdh11x的细胞定位进行了一系列研究。为此,我们对Pcdh11x和GFAP及Pcdh11x和NeuN分别进行了共标。通过将Pcdh11x和GFAP共标,进行免疫荧光检测,结果显示GFAP主要表达于胼胝体和皮层边缘区,侧脑室边缘区,而Pcdh11x主要表达于皮层,两者表达于完全不同的脑区,未发现在同一细胞共标的现象。而将Pcdh11x和NeuN共标进行免疫荧光检测,我们发现Pcdh11x完全表达于NeuN+的细胞。以上结果表明Pcdh11x主要定位于NeuN+细胞,不表达于GFAP+细胞。为了对结果进行验证,我们用pCAG-pcdh11x-GFP和pCAG-GFP质粒转染293T细胞,再进行Pcdh11x的免疫荧光染色,结果显示pCAG-pcdh11x-GFP组GFP可与Pcdh11x完全重叠,而向293T细胞转染pCAG-GFP质粒后,Pcdh11x的免疫荧光染色结果则显示并未检测到Pcdh11x信号。这一结果表明Pcdh11x的抗体具有较强的特异性。结合前面抗体阻断肽的的结果,可以认为上述的免疫组化及免疫荧光结果可靠,可作为下步实验的参考依据。 3.小鼠脑内不同发育时间点Pcdh11x的表达情况为了进一步研究Pcdh11x在小鼠脑发育过程中所起的作用,我们用荧光定量PCR的方法对Pcdh11x在小鼠胚胎期12天,14天,16天,生后1天,4天和7天在皮层,海马和侧脑室的表达情况进行了分析。在胚胎期12天,14天,16天,18天,生后1天,4天和7天对大脑皮层的Pcdh11x mRNA进行分析,胚胎期14天,16天,18天,生后1天,4天和7天各不同发育时间点之间Pcdh11x的表达有统计学差异(F=53.209,P=0.000),分别与胚胎期12天Pcdh11x的表达相比,Pcdh11x在胚胎期14天(1.000±0.000vs.0.052±0.025；P0.050),胚胎期16天(1.000±0.000vs.0.395±0.184；P0.050),胚胎期18天(1.000±0.000vs.0.391±0.021；P0.050)和生后1天(1.000±0.000vs.0.296±0.028；P0.050)均有统计学差异,从结果来看表达较弱。在胚胎期14天,16天,生后1天,4天和7天对大脑海马区的Pcdh11x mRNA进行分析,胚胎期16天,18天,生后1天,4天和7天各不同发育时间点Pcdh11x的表达有统计学差异(F=31.393,P=0.002),分别与胚胎期14天相比,Pcdh11x在胚胎期16天(1.000±0.000vs.0.221±0.212；P0.050),胚胎期18天(1.000±0.000vs.0.257±0.089; P0.050),生后1天(1.000±0.000vs.1.844±0.202; P0.050),生后7天(1.000±0.000vs.0.556±0.039; P0.050)的表达均有统计学差异,从结果来看胚胎期16天,胚胎期18天,生后7天表达较弱,而生后1天Pcdh11x的表达量较高。在胚胎期12天,14天,16天,18天,生后1天,4天和7天对大脑侧脑室区和脑室下区的Pcdh11x mRNA进行分析,胚胎期14天,16天,18天,生后1天,4天和7天各不同发育时间点之间Pcdhllx的表达有统计学差异(F=4.279,P=0.018),与胚胎期12天相比,生后1天(1.000±0.000vs.6.964±1.171；P0.050)、生后7天(1.000±0.000vs.10.181±2.463; P0.050) Pcdh11x的表达有统计学差异,生后1天和生后7天Pcdh11x表达较强,而Pcdh11x的表达在其他各时间点的表达与胚胎期12天相比,无统计学差异(P0.050)。综上所述,Pcdh11x mRNA的表达是动态变化的,可能在神经系统发育过程中发挥重要作用。 4. Pcdh11x主要表达于神经干细胞从上述的研究我们得知,Pcdh11x在脑内分布广泛,并在胚胎发育过程中动态表达,可能在神经系统发育过程中发挥重要作用,那么Pcdh11x与在神经发育过程中具有自我更新、多向分化潜能的神经干细胞之间有什么关联成为我们接下来的研究目标。我们用Pcdh11x与Nestin双标或Pcdh11x与Sox-2进行免疫荧光检测。通过对体外神经干细胞培养和胚胎期16天的脑组织进行Pcdh11x与Nestin双标,我们发现Pcdh11x与Nestin共表达。通过对体外神经干细胞培养和胚胎期14天的脑组织进行Pcdh11x与Sox-2的双标,我们发现Pcdh11x同样可以与Sox-2共标。同时,为了进一步验证神经干细胞中Pcdh11x与Nestin和Sox-2的表达情况,我们利用了PCR的方法对其mRNA进行检测,结果发现神经干细胞中可同时表达Pcdh11x及Nestin和Sox-2的mRNA.综上所述,Pcdh11x广泛表达于小鼠脑内,并在小鼠神经系统发育过程中发挥重要的作用,同时可能是神经干细胞发挥自我更新及多向分化潜能的重要分子基础。结论 1. Pcdh11x属于原钙粘蛋白超家族,主要表达于小鼠脑内,并在不同脑区均有分布,免疫组化结果显示Pcdh11x主要表达于皮层与下丘脑脑区； 2. Pcdh11x的细胞定位主要为NeuN+神经元,并不表达于GFAP+细胞； 3. Pcdh11x在小鼠胚胎发育期主要定位于Nestin+/Sox-2+的神经干细胞,参与小鼠神经系统发育。第二章Pcdh11x调控神经干细胞的增殖、分化和迁移研究目的研究Pcdh11x对神经干细胞增殖、分化和迁移的影响。技术方法 1.研究Pcdh11x对神经干细胞增殖、分化和迁移的影响利用体内、体外RNA干扰手段,检测转染抑制表达(pcdh11x-shRNA)和过表达Pcdh11x (pCAG-pcdh11x-GFP)质粒后对神经干细胞增殖(BrdU, Ki67)的影响；利用体外转染抑制表达(pcdh11x-shRNA, pcdh11x-siRNA)和过表达Pcdhllx(pCAG-pcdh11x-GFP)质粒的手段,检测Pcdhllx对神经干细胞向神经元方向分化(Tuj-1)的影响；利用子宫内电转的手段在体转染pcdh11x-shRNA抑制表达质粒或pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒,检测Pcdhllx对神经干细胞分化(Ctip2, Tbrl, Tbr2, Pax-6)的影响以及对细胞迁移(GFP+细胞)的影响；利用流式细胞术检测转染nc-shRNA, pcdh11x-shRNA, pCAG-GFP和pCAG-pcdh11x-GFP对神经干细胞凋亡的影响。 2.统计学分析所有数据均代表三次以上重复实验的结果,使用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理。采用单向方差分析(One-Way ANOVA)及独立样本t检验(independent sample T test)等统计方法进行统计。数据用均数±标准差(；±SD)表示。P0.050为差异有统计学意义。研究结果 1.Pcdh11x可促进神经干细胞的增殖通过向培养的神经干细胞分别转染nc-siRNA对照质粒和pcdh11x-siRNA干扰质粒,48h后,我们对其进行BrdU标记,孵育2h后,进行免疫荧光染色观察,结果显示抑制表达Pcdh11x后,与nc-siRNA对照质粒相比,差异有统计学意义(t=15.913,P=0.000), pcdh11x-siRNA干扰质粒组与对照组相比BrdU阳性率显著下降(11.383±4.497vs.4.055±2.189),表明抑制表达Pcdh11x可明显抑制神经干细胞的增殖。通过子宫内电转的方法,我们将pcdh11x-shRNA的质粒和对照质粒在体转染胚胎期14天胎脑,3天后,切片观察Ki67的表达情况,结果显示对照质粒组与pcdh11x-shRNA质粒组之间差异有统计学意义(F=31.052,P=0.000),与对照质粒组相比,Ki67阳性率在pcdh11x-shRNA质粒组显著下降(19.230±1.815vs.12.661±4.070),可在体明显抑制Ki67的表达,再次表明抑制表达Pcdh11x可明显抑制神经干细胞的增殖。通过向培养的神经干细胞分别转染pCAG-GFP对照质粒和pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒,48h后,我们对其进行BrdU标记,孵育2h后,进行免疫荧光染色观察,结果显示两组之间的差异有统计学意义(t=-8.889,P=0.000),与pCAG-GFP对照质粒组相比,pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒组BrdU阳性率显著升高(7.893±3.359vs.19.413±3.216),表明过表达Pcdh11x可明显促进神经干细胞的增殖。通过子宫内电转的方法,我们将pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒和对照质粒在体转染胚胎期14天胎脑,3天后,切片观察Ki67的表达情况,结果显示各组之间差异有统计学意义(F=31.052,P=0.000),pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒组可在体明显促进Ki67的表达(19.230±1.815vs.24.092±1.024),再次表明过表达Pcdh11x可明显促进神经干细胞的增殖。 2. Pcdh11x可抑制神经干细胞的分化通过向培养的神经干细胞分别转染nc-siRNA对照质粒和pcdh11x-siRNA干扰质粒,5-7天后,我们对其进行免疫荧光染色观察,结果显示两组之间的差异有统计学意义(t=-7.618,P=0.000),pcdh11x-siRNA干扰质粒组可使Tuj-1阳性细胞的比例显著升高(15.028±6.212vs.23.996±9.895)。同样,我们根据nc-siRNA对照质粒和pcdh11x-siRNA干扰质粒序列设计合成了更加稳定的nc-shRNA和pcdh11x-shRNA,结果显示nc-shRNA组和pcdh11x-shRNA组之间的差异有统计学意义(t=-2.766,P=0.011),pcdh11x-shRNA组可使Tuj-1阳性细胞的比例显著升高(26.393±1.9035vs.49.814±22.920),表明抑制表达Pcdh11x可明显促进神经干细胞向神经元方向的分化。通过子宫内电转的方法,我们将pcdh11x-shRNA的质粒和对照质粒在体转染胚胎期14天胎脑,3天后,切片观察皮层分化神经干细胞不同标志物(包括Ctip2, Tbrl, Tbr2, Pax6)的表达情况,结果显示各组之间的差异有统计学意义(Ctip2+:t=-5.784, P=0.000; Tbrl+:t=-8.899, P=0.000; Tbr2+:t=-4.060, P=0.001; Pax6+:t=12.442, P=0.000),抑制表达Pcdhllx后可明显促进Ctip2+大脑皮层V层和VⅥ层神经元(0.056±0.006vs.0.112±0.027), Tbrl+大脑皮层VⅥ层神经元(0.142±0.021vs.0.241±0.023)和Tbr2+基底祖细胞(Basal Progenitors)的表达(0.049±0.031vs.0.097±0.013),相反,对Pax6+放射状胶质细胞／顶端祖细胞(Radial Glia/Apical Progenitors)的表达有明显的抑制作用(0.139±0.008vs.0.080±0.011),表明抑制表达Pcdhllx可明显促进神经干细胞向神经元方向的分化。通过向培养的神经干细胞分别转染pCAG-GFP对照质粒和pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒,5-7天后,我们对其进行免疫荧光染色观察,结果显示两组之间的差异有统计学意义(t=6.083,P=0.000),过表达Pcdhllx后,可使Tuj-1阳性细胞的比例显著性下降(25.462±6.235vs.13.074±3.737)。表明过表达Pcdhllx可明显抑制神经干细胞向神经元方向的分化。通过子宫内电转的方法,我们将pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒在体转染胚胎期14天的胎脑,3天后,切片观察皮层分化神经干细胞不同标志物(包括Ctip2, Tbr1, Tbr2, Pax6)的表达情况,结果显示各组之间的差异有统计学意义(Ctip2+:t=15.137,P=0.000; Tbrl+:t=8.898, P=0.000; Tbr2+:t=9.767, P=0.000; Pax6+:t=-10.122, P=0.000)过表达Pcdhllx后可明显抑制Ctip2+大脑皮层V层和VⅥ层神经元(0.072±0.009vs.0.018±0.004),Tbr1+大脑皮层VⅥ层神经元(0.122±0.013vs.0.066±0.012)和Tbr2+基底祖细胞(Basal Progenitors)的表达(0.075±0.012vs.0.021±0.010),相反,对Pax6+放射状胶质细胞／顶端祖细胞(Radial Glia/Apical Progenitors)的表达有明显的促进作用(0.123±0.013vs.0.192±0.015),表明过表达Pcdhllx可明显抑制神经干细胞向神经元方向的分化。 3. Pcdhllx抑制神经干细胞向皮层远端的迁移通过子宫内电转的方法,我们将nc-shRNA对照质粒,pcdh11x-shRNA抑制表达质粒和pCAG-pcdh11x-GFP过表达质粒在体转染胚胎期14天的胎脑,3天后,切片观察GFP阳性细胞的迁移情况。结果显示在CP区,IZ区和SVZ/VZ区各组之间的差异均有统计学意义(CP:F=29.362, P=0.004; IZ:F=4.496, P=0.044; SVZ/VZ:F=35.387, P=0.002),抑制表达Pcdhllx可明显促进GFP+细胞离开侧脑室／脑室下区迁移到皮层板区(CP:0.124±0.035vs.0.167±0.054; IZ:0.541±0.057vs.0.599±0.054; SVZ/VZ:0.335±0.025vs.0.234±0.010),而过表达Pcdhllx则抑制GFP+细胞离开侧脑室／脑室下区迁移向皮层板区的迁移(CP:0.124±0.035vs.0.015±0.005; IZ:0.54±0.057vs.0.498±0.022; SVZ/VZ:0.335±0.025vs.0.425±0.068)。 4.抑制表达或过表达质粒转染对神经干细胞凋亡的影响本课题多次转染抑制表达或过表达的质粒,质粒本身对细胞的毒性作用如何,是否对我们的实验结果造成大的影响,以及是否通过影响细胞的凋亡进而影响细胞的增殖和分化,这将直接影响本课题数据及结论的可靠性,为此,我们对各组进行了检测。我们利用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒对各组进行检测,结果显示nc-shRNA组,抑制表达Pcdhllx组,pCAG-GFP组和过表达Pcdhllx组,与阴性对照组相比凋亡细胞均有所增加,然而nc-shRNA组,抑制表达Pcdhllx组,pCAG-GFP组和过表达Pcdhllx组之间的凋亡情况并无明显改变。说明四组转染后对细胞的毒性是一致的,也没有通过影响细胞的凋亡进而影响细胞的增殖和分化,对本课题的结论并未造成大的影响。结论 1.体外实验结果表明抑制表达Pcdhllx能够促进神经干细胞向神经元方向的分化,同样体外过表达Pcdhllx可抑制神经干细胞向神经元方向的分化； 2.在体实验结果表明抑制表达Pcdhllx,可明显促进Ctip2+大脑皮层V层和Ⅵ层神经元,Tbrl+大脑皮层Ⅵ层神经元和Tbr2+基底祖细胞的表达,相反,对Pax6+放射状胶质细胞/顶端祖细胞的表达有明显的抑制作用； 3.同理,在体实验结果表明过表达Pcdhllx,可明显抑制Ctip2+大脑皮层V层和Ⅵ层神经元,Tbrl+大脑皮层Ⅵ层神经元和Tbr2+基底祖细胞的表达,相反,对Pax6+放射状胶质细胞/顶端祖细胞的表达有明显的促进作用； 4.本课题的体内、体外实验结果均表明过表达Pcdhllx,可明显促进神经干细胞的增殖；在体抑制表达Pcdhllx,可明显抑制神经干细胞的增殖； 5.在体实验表明抑制表达Pcdhllx可明显促进GFP+细胞离开侧脑室/脑室下区迁移到皮层板区,而过表达Pcdhllx则抑制GFP+细胞离开侧脑室/脑室下区迁移向皮层板区的迁移。综上所述,我们的研究表明Pcdhllx在小鼠神经系统发育中发挥重要作用,可促进神经干细胞的增殖,并对其分化有明显的抑制作用；我们的在体实验也进一步证实了体外结果,表明Pcdhllx抑制神经干细胞退出细胞周期,向皮层远端迁移,促进神经干细胞的自我更新。这一研究成果为深入理解原钙粘蛋白在神经细胞中的作用提供了实验参考。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

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