利美尼定对过表达ALS相关毒性蛋白质NSC34细胞的干预研究

发布时间：2018-03-17 12:04

本文选题：肌萎缩侧索硬化　切入点：利美尼定　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种选择性累及上下运动神经元为特点的神经系统变性病，一般在成年起病，多在起病后的3到5年因致命性呼吸衰竭死亡，目前尚无有效的治愈方法。ALS确切的致病机制迄今未明，目前研究的热点是SOD1基因和TDP-43基因突变，这两个基因的突变可以使细胞内蛋白异常折叠和聚集，产生运动神经元变性，从而导致ALS的发生和发展。细胞内异常形成和聚集的蛋白主要通过自噬途径被降解。为了寻找能应用于临床的安全自噬诱导剂，Claudia Rose等人筛查了美国食品药品监督局（FDA）批准上市的药品中发现利美尼定（rilmenidine），主要作用于中枢的降压药，可乐定的类似物，它在亨廷顿病鼠模型中能够上调自噬，减少突变的亨廷顿蛋白的水平。此外，利美尼定还能减轻亨廷顿病鼠模型的疾病症状。亨廷顿病（Huntington’sdisease，HD)是由于突变的亨廷顿蛋白在胞内异常聚集从而引起神经元变性死亡。因此我们为了证实利美尼定是否能够诱导自噬，降解NSC34细胞内与ALS相关的异常的毒性蛋白。我们在NSC34细胞系中应用利美尼定，通过蛋白免疫印迹（western blotting）的方法来检测LC3-Ⅱ水平，首先来验证利美尼定是否有诱导自噬的作用。再将WT SOD1、G93ASOD1、WT TDP-43、TDP-25、TDP-35质粒转染至NSC34细胞系构建ALS细胞模型，通过蛋白免疫印迹的方法对比用药组和空白组中外源性蛋白的表达水平。最后应用特异性自噬抑制剂3-MA（3-methyl adenine，3-MA）证明利美尼定是通过自噬途径降解细胞内异常聚集的蛋白。综上，我们的数据表明利美尼定可以在ALS细胞模型中通过自噬途径清除细胞中异常的毒性蛋白，可能达到对神经元的保护作用。这就为以后探索利美尼定在ALS等变性疾病动物模型中保护性机制，甚至为后续变性病的临床试验研究提供了一定的实验数据和理论基础。方法： 1细胞培养及SOD1、TDP-43转染NSC34细胞系的建立 NSC34细胞系是具有很多运动神经元特性的杂交细胞系，我们用10%灭活胎牛血清、青霉素及链霉素配制的高糖DMEM作为其培养液，使其在37℃、含有5%二氧化碳的温箱中生长传代。我们应用lipofectamineTM2000转染试剂用瞬时转染的方法将EGFP-WT SOD1、EGFP-G93A SOD1和EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WT TDP-43质粒分别转染至NSC34细胞。转染了EGFP-WT SOD1、EGFP-G93ASOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WT TDP-43质粒的NSC34细胞在上述培养液中进行生长传代。 2治疗药物与干预方案将NSC34细胞分为给药干预组和对照组，将利美尼定储备液配制成1um、5um、10um、20um不同浓度的工作液分别对NSC34细胞进行干预，利用western blotting的方法检测NSC34细胞中LC3及P62的蛋白质表达水平，来探索利美尼定上调自噬的最佳作用浓度。把过表达EGFP-WTSOD1、EGFP-G93A SOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35、MYC-WTTDP-43的NSC34细胞分别分为给药干预组和对照组，通过westernblotting的方法检测细胞中过表达蛋白的表达水平，来观察利美尼定是否有降解蛋白质的作用。应用自噬通路特异性阻断剂3-MA干预过表达EGFP-TDP-25的NSC34细胞，用western blotting的方法检测过表达蛋白的表达水平，来进一步验证利美尼定是否通过自噬通路降解细胞内异常聚集的蛋白。 3蛋白免疫印迹收集细胞，提取总蛋白。应用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白的浓度，，每个蛋白样本进行10%或12%的钠十二烷基的硫酸盐（SDS）聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，凝胶上蛋白就转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将这些包含有蛋白的PVDF膜与一抗在4℃下孵育过夜。第二天经过洗膜后，再与结合有荧光染料的二抗孵育。最后用Odyssey红外图像扫描系统对PVDF膜进行扫描以确定某一蛋白的表达。结果： 1利美尼定对NSC34细胞中内源性蛋白LC3-Ⅱ及P62表达水平的影响。通过应用western blotting检测NSC34细胞内LC-Ⅱ及P62表达水平，结果显示应用1uM、5uM、10uM、20uM的利美尼定干预NSC34细胞后LC3-Ⅱ的表达水平均高于空白对照组，但在利美尼定浓度为10uM时最明显，差别具有统计学意义（P㩳0.05），而P62在此条件下下降最明显，差别具有统计学意义（P㩳0.05）。 2利美尼定对ALS疾病相关蛋白质表达水平的影响。我们应用的质粒带有EGFP或MYC标签，应用抗EGFP抗体或抗MYC抗体检测各类蛋白质的变化。结果显示利美尼定降低过表达EGFP-G93A SOD1、EGFP-TDP-25、EGFP-TDP-35的NSC34细胞中表达的外源性蛋白的水平，给药干预组和空白对照组差别具有统计学意义（P㩳0.05），而对过表达MYC-WT TDP-43和EGFP-WT SOD1的NSC34细胞中表达的外源性蛋白的水平无影响，给药干预组和空白对照组的差别无统计学意义（P0.05）。 3自噬通路的特异性阻断剂3-MA对利美尼定降解蛋白质作用的影响。应用抗EGFP抗体检测过表达EGFP-TDP-25的NSC34细胞内表达的外源性TDP-25蛋白，结果显示应用3-MA和利美尼定干预组中TDP-25蛋白的表达水平较单独应用利美尼定干预组显著上升，差别具有统计学意义（P㩳0.05）。结论： 1给予利美尼定干预后，NCS34细胞内源性的自噬泡标志分子LC3-Ⅱ表达水平明显升高，而介导被降解蛋白与LC3-Ⅱ相连接的自噬流的标记分子P62表达水平明显下降，证实了利美尼定具有上调自噬的作用。 2因为已经证实基因突变引起细胞内蛋白质的异常聚集和折叠，从而对细胞产生毒性作用，可以导致ALS的发生。我们将与ALS致病相关的WT SOD1、G93A S0D1、TDP-25、TDP-35、WT TDP-43质粒转染至NSC34细胞内，给予利美尼定干预后过表达G93AS0D1、TDP-25、TDP-35的NSC34细胞中外源性蛋白的表达水平较空白对照组明显下降，而过表达的WTSOD1、WT TDP-43的NSC34细胞中外源性蛋白的表达水平较空白对照组无明显差异。因此，我们得出利美尼定可以清除ALS细胞模型中与致病相关的毒性蛋白。利美尼定能够促进G93AS0D1、TDP-25、TDP-35的降解，而对WT SOD1以及WT TDP-43没有降解作用。 3因为细胞内异常聚集的蛋白主要是通过两个途径清除：自噬-溶酶体途径和泛素化-蛋白酶体途径，为了证实利美尼定是通过自噬途径清除细胞内的毒性蛋白，我们在本实验中加用特异性自噬通路抑制剂3-MA(3-methyl adenine,3-MA)，将3-MA和利美尼定同时作用于过表达TDP-25的NSC34细胞与利美尼定单独作用于过表达TDP-25的NSC34细胞比较发现，3-MA减弱利美尼定降解蛋白质的作用，即当自噬通路被抑制时利美尼定降解细胞内毒性蛋白的作用下降。 4综上所述，我们发现利美尼定在ALS细胞模型中通过自噬途径清除细胞内的毒性蛋白质，从而发挥对细胞的保护作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R744.5

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