基于鸡胚尿囊腔动脉的脑血管痉挛模型的建立及甘草酸苷对尿囊腔动脉血管痉挛的作用与机制研究

发布时间：2018-03-17 18:33

本文选题：尿囊腔动脉　切入点：脑血管痉挛　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:脑血管痉挛(CVS)是蛛网膜下腔出血(SAH)后致死致残的主要原因。预防及治疗CVS一直是提高SAH患者生存质量的关键。对于CVS的发病机制及药物治疗的研究多基于各种动物模型,差异性很大,存在多种假设,尚没有一种动物模型能够完全模拟人类SAH后CVS的特点。Yu等在2011年首次报道了使用氧合血红蛋白刺激鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管痉挛模拟CVS变化的实验研究。我们在重复鸡胚CAM血管痉挛模型时发现鸡胚尿囊腔动脉(Allantoic cavity artery,ACA)所处的液体环境与人脑血管所处的蛛网膜下腔液体环境很相似,附于蛋壳内面的鸡胚CAM血管在灯光照射下清晰可见,通过针刺即可以造成尿囊腔内出血,操作方便,容易观察。基于鸡胚ACA的这种特点,我们尝试通过针刺CAM血管引起鸡胚尿囊腔内出血,观察是否可以诱导鸡胚ACA的血管痉挛,模拟SAH出血后CVS的病理变化。甘草酸苷(GL)是甘草属植物根茎提取物的有效成分,具有广泛的生物学活性,包括抗炎症反应,抗氧化应激及自由基清除等作用。有学者报道了甘草酸苷在缺血再灌注损伤中的应用,研究结果显示GL能够显著的降低小鼠大脑中动脉梗塞模型的梗死面积,改善神经功能,抑制脑水肿,并能降低脑组织中TNF-a,IL-6,COX-2,i NOS,NF-kB及GFAP的表达水平,显示GL的神经保护功能主要跟其抗炎抗氧化应激功能相关。但是GL在SAH后CVS的应用研究较少,我们在成功构建的针刺鸡胚CAM血管致尿囊腔出血诱导ACA血管痉挛模型的基础上,验证了不同剂量的GL在治疗鸡胚ACA血管痉挛模型中的作用效果,并通过蛋白电泳的方法检测了氧化应激相关指标,炎症反应相关因子,细胞凋亡相关蛋白及MAPK通路蛋白的表达变化,阐述了GL治疗鸡胚ACA血管痉挛的可能机制。研究目的:尝试建立基于鸡胚ACA的一种新的脑血管痉挛研究模型,并验证GL在ACA血管痉挛模型中的治疗作用,阐述相关机制。研究方法:(1)通过解剖11日龄鸡胚,尿囊腔注射美兰实验,病理切片及透射电镜(TEM)的方法观察鸡胚尿囊腔及ACA血管的组织结构特点,探讨了鸡胚ACA血管模拟SAH后CVS的解剖学基础。(2)180只SPF级新鲜鸡胚种蛋,随机分为正常对照(Control)组40只,假手术(Sham)组40只,实验模型(Model)组80只,各组再随机等分为1day、3day、5day、7day四个亚组,其余备用。孵化至11日龄时,Model组先使用16G注射器针头轻轻钻破蛋壳,不要伤及CAM血管,然后使用26 G注射器针头刺破CAM血管,照蛋灯下能看到明显的出血,轻轻转动鸡胚,让血液在尿囊腔内均匀弥散,尝试建立鸡胚尿囊腔出血诱导的ACA血管痉挛模型。Sham组仅用16G注射器针头钻破蛋壳,不刺破CAM血管,Control组不做任何操作。(3)分别于造模后1day,3day,5day,7day处死鸡胚,获取Control组,Sham组及Model组尿囊液及ACA血管标本,通过组织切片,免疫组化,TUNEL染色,透射电镜(TEM)检查,蛋白电泳等方法,观察ACA血管内径横截面积、管壁厚度及管壁超微结构的变化,尿囊腔内血红蛋白浓度的变化,及ACA组织内氧化应激相关蛋白,炎症反应相关蛋白,凋亡相关蛋白表达水平的变化。(4)120只SPF级新鲜鸡胚种蛋,随机分为假手术(Sham)组,实验模型(Model)组,实验模型+0.9%生理盐水(Model+NS)组,实验模型+低剂量GL(Model+3μg GL)组,实验模型+高剂量GL(Model+6μg GL)组,每组20只,其余备用。孵化至11日龄时,通过针刺CAM血管方法造模,Sham组不刺破CAM血管。造模后即刻,Model+NS组,每日给予10μl/g的0.9%生理盐水;Model+3μg GL组,每日给予10μl/g的0.3μg/μl的GL0.9%生理盐水溶液;Model+6μg GL组每日给予10μl/g的0.6μg/μl的GL0.9%生理盐水溶液,以上分剂量均分两次给药,12h一次。Sham组及Model组不给药。在造模后5day处死鸡胚,分别获取各组ACA血管标本,通过病理切片观察不同剂量的GL对鸡胚ACA血管内径横截面积及管壁厚度的影响,并通过蛋白电泳的方法检测氧化应激相关指标,炎症反应相关因子,细胞凋亡相关蛋白及MAPK通路蛋白的表达变化,阐述GL治疗鸡胚ACA血管痉挛的可能机制。结果:(1)鸡胚ACA血管所处的液体环境与人类wills环动脉血管所处的蛛网膜下腔环境相似,尿囊腔注射美兰可见ACA着色,ACA在病理学组织结构特点上与人类脑动脉血管接近。(2)尿囊腔出血模型(Model)组鸡胚的死亡率显著增加。(3)Model组在造模后3day,5day,7day时,ACA血管内径横截面积明显减小,管壁厚度明显增加。(4)TUNEL染色及TEM观察结果显示:Model组ACA血管细胞凋亡指数显著增高,内皮细胞排列疏松,失去细胞间正常的连接,细胞核核质碎裂,向核膜周边聚集,内皮下弹力层可见波浪形皱褶,管壁内可见炎性细胞的浸润。(5)Model组氧合血红蛋白及脱氧血红蛋白浓度与ACA血管内径横截面积及管壁厚度的变化趋势相一致。(6)Model组ACA组织内SOD,GR,CAT的活性及表达水平明显下降,i NOS表达水平明显增高,MDA浓度显著升高;IL-6,IL-1b及TNF-a表达水平增高;PCNA表达水平增高,a-SMA在造模后5day表达水平下降;ET-1及ETRA的表达水平升高;HIF-1a及VEGF的表达水平亦明显增高;C-Caspase3表达水平升高,而Bcl-2表达水平下调。(7)GL能够明显提高尿囊腔出血模型鸡胚的存活率。(8)GL能够缓解尿囊腔出血后ACA血管痉挛,高剂量组更加显著,但不能完全逆转。(9)GL能够缓解尿囊腔出血模型后ACA组织内SOD,GR,CAT的表达水平下降及i NOS表达水平增高;缓解IL-6,IL-1b及TNF-a表达水平增高;缓解C-Caspase3的表达水平升高及Bcl-2表达水平下调;以及缓解MAPK信号通路p-P38/P38,p-JNK/JNK蛋白表达水平比例的升高,高剂量组更加明显;GL不影响p-ERK/ERK蛋白表达水平比例的变化。结论:(1)鸡胚ACA所处的液体环境与人类wills环动脉血管所处的蛛网膜下腔环境相似,组织结构上也与人类脑动脉血管接近,是模拟SAH后CVS的解剖学基础。(2)鸡胚尿囊腔出血模型能够诱导ACA出现与人类SAH后CVS相似的病理学改变,为CVS的研究提供一种新的模型选择。(3)尿囊腔出血后血红蛋白代谢过程、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、平滑肌细胞表型转化等参与ACA血管痉挛的发生。(4)GL能够缓解尿囊腔出血后ACA组织中的氧化应激,炎症反应及细胞凋亡水平,提高尿囊腔出血模型鸡胚的存活率,改善ACA的血管痉挛。(5)GL对尿囊腔出血后ACA血管痉挛的缓解作用依赖于对MAPK信号通路p-P38/P38,p-JNK/JNK蛋白表达的影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3;R-332

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