3%氯化钠对脂多糖小鼠脑水肿的保护作用及非渗透机制研究

发布时间：2018-03-18 00:05

本文选题：3%氯化钠　切入点：高渗盐水　出处：《中南大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景脑水肿是临床常见危急重症。由脑水肿所引起的颅内高压可引起脑血流的减少和继发性缺血性脑损伤的发生,也可引起脑疝的形成而危及生命。高渗钠溶液在临床上已广泛应用于脑外伤、脑出血、脑梗塞所致脑水肿等的治疗。目前常用的高渗钠浓度有3%、5%、7.5%、10%、23.4%,大量临床及动物实验研究均证实了其疗效.近年来大量文献报道,证实高渗钠溶液治疗脑水肿的疗效优于甘露醇,而且其副作用少。高渗钠治疗脑水肿具体的机制尚不完全清楚,其可能的机制有(1)渗透性作用；(2)增加局部脑组织灌注；(3)减轻脑损伤后的炎症反应；(4)恢复细胞膜Na+,K+-ATP酶活性等。Zeng HK在大鼠缺血性脑损伤模型上发现10%氯化钠可下调星形胶质细胞水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)的表达。本研究组前期实验发现3%氯化钠可下调兔大肠杆菌脑膜炎脑组织AQP4的表达。这提示3%氯化钠可能通过下调AQP4的表达减轻脑水肿。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是大肠杆菌细胞壁上的主要成分,也是其主要的致病成分,与脑水肿的发生密切相关。本研究进一步观察3%氯化钠对脂多糖所致脑水肿及脑组织炎症因子、AQP4表达的影响,探讨3%氯化钠治疗脑水肿的非渗透机制。目的 (1)观察3%氯化钠对脂多糖小鼠脑水肿及脑组织炎症因子、AQP4表达的影响,探讨3%氯化钠治疗脂多糖小鼠脑水肿的非渗透机制。 (2)在细胞水平探讨蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)在3%氯化钠下调AQP4表达中的作用。1建立小鼠脂多糖脑水肿模型 1.1方法 (1)观察脂多糖对脑组织含水量变化的时效和量效作用：昆明小白鼠随机分为2大组：对照组(control组)和脂多糖组(LPS组),各组小鼠数见后面实验结果中。脂多糖组小鼠予以腹腔注射脂多糖(10、20、40mg/kg),对照组小鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水,分别于脂多糖注射6、12小时后将小鼠处死,迅速取出大脑进行含水量测定。 (2)观察脂多糖对脑组织免疫球蛋白G含量及细胞因子的影响：昆明小白鼠随机分为2大组：对照组(control组)和脂多糖组(LPS组),各组小鼠数见后面实验结果中。脂多糖组小鼠予以腹腔注射脂多糖10mg/kg,对照组小鼠腹腔注射同等剂量的生理盐水,分别于注射脂多糖8、12小时后将小鼠处死,迅速取出大脑进行相关测定。Real-time RT-PCR检测脑组织白介素β (interleukin-1beta, IL-1β)和肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor alfa, TNF-α) mRNA含量,ELISA法检测IL-1β、TNF-α和免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)蛋白含量。统计方法两样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析, P0.05认为有统计学意义。 1.2结果 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)6小时或12小时后,各组脑组织含水量明显增加,和对照组相比有显著性差异(p0.05),各脂多糖组间脑组织含水量无差异。 (2)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小时,脑组织含水量明显增加,高于对照组(p0.05),同时脑组织IgG含量增加,与对照组比较有明显的差异(p0.05)；注射脂多糖12小时后脑组织IgG含量也明显增加,与对照组比较有明显的差异(p0.05),但与8小时组比较无明显差异(p0.05)。 (3)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)8小时或12小时,脑组织中IL-1βmRNA及蛋白的含量明显增高,与对照组相比均有显著差异(p0.01,p0.05)；脂多糖组间脑组织IL-1βmRNA及蛋白含量无差异；脑组织中TNF-αmRNA及蛋白含量的变化规律与IL-1β一致。 1.3结论 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小时后可诱导产生脑水肿,增加脂多糖的作用时间延长及剂量不再提高水肿的程度,表明腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小时后可以成功诱导稳定的脂多糖脑水肿模型。 (2)腹腔注射脂多糖所致脑水肿时血脑屏障通透性增高、脑组织细胞因子IL-1β和TNF-a的表达增加。 23%氯化钠对脂多糖小鼠脑水肿的保护作用及可能机制 2.1方法昆明小白鼠随机分为3组：对照组(control组),脂多糖组(LPS组)和3%氯化钠组(HS组),各组小鼠数目见后面实验结果中。脂多糖组和3%氯化钠组小鼠予以腹腔注射脂多糖(10mg/kg),对照组小鼠予以腹腔注射相同剂量的生理盐水。于脂多糖注射后6小时,对照组和脂多糖组尾静脉注射生理盐水(20ml/kg),3%氯化钠组各尾静脉注射3%氯化钠(20ml/kg),尾静脉注射3%氯化钠或生理盐水2小时或6小时后处死小鼠,迅速断头,取脑组织进行相关检查。测定脑组织含水量,Real-time RT-PCR检测脑组织IL-1β、TNF-α、AQP-4mRNA含量,ELISA法检测IL-1β、TNF-α和IgG蛋白含量,Western blotting检测脑组织AQP-4蛋白含量。统计方法两样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析,P0.05认为有统计学意义。 2.2结果 (1)3%氯化钠组治疗2小时后脑组织含水量明显减少,低于脂多糖组(p0.05),治疗6小时后脑组织水含量仍然低于脂多糖组,但和2小时组无明显差异。 (2)3%氯化钠组治疗2小时后脑组织IgG含量和脂多糖组无明显差异(p0.05)；治疗6小时后3%氯化钠组脑组织IgG含量明显降低(p0.05),低于脂多糖组(p0.05)。 (3)3%氯化钠组治疗2小时后,脑组织中IL-1βmRNA明显减低,与脂多糖组比较有明显的差异(p0.01)；脑组织中IL-1β蛋白含量虽有下降趋势,但与脂多糖组比较无明显的差异(p0.05)。3%氯化钠组治疗6小时后,脑组织中IL-1βmRNA进一步减少(p0.01),而IL-1β蛋白无进一步减少(p0.05),但与脂多糖组比较均有明显的差异(p0.01)。脑组织中TNF-αmRNA及蛋白含量的变化规律与IL-1β的一致。 (4)3%氯化钠组治疗2小时后,脑组织中AQP-4mRNA即明显减低,与LPS组比较有明显的差异(p0.01),但随着治疗时间延长,脑组织中脑组织中AQP-4mRNA无进一步下降现象,而脑组织AQP-4蛋白含量在治疗2小时后虽与LPS组比较无明显的差异(p0.05)。但随着治疗时间延长,脑组织中AQP-4蛋白含量明显减少(p0.05),在3%氯化钠组治疗6小时后,脑组织中AQP-4蛋白与脂多糖组比较有明显的差异(p0.05)。 2.3结论 (1)3%氯化钠可减轻脂多糖诱导的小鼠脑水肿,下调脑水肿时脑组织炎症因子的表达和产生。 (2)3%氯化钠可抑制脂多糖诱导的小鼠脑水肿时脑组织AQP4的表达,减少炎症因子的表达和产生可能是3%氯化钠抑制AQP4表达的机制之一。 3PKC在3%氯化钠抑制AQP4表达中的作用 3.1方法 (1)观察3%氯化钠对小鼠脂多糖脑水肿时脑组织膜性结构中PKCa含量的影响：昆明小白鼠随机分为3组：对照组(control组),脂多糖组(LPS组)和3%氯化钠组(HS组),各组小鼠数目见后面实验结果中。脂多糖组和3%氯化钠组小鼠予以腹腔注射脂多糖(10mg/kg),对照组小鼠予以腹腔注射相同剂量的生理盐水。于脂多糖注射后6小时,对照组和脂多糖组尾静脉注射生理盐水(20ml/kg),3%氯化钠组各尾静脉注射3%氯化钠(20ml/kg),尾静脉注射3%氯化钠或生理盐水2小时或6小时后处死小鼠,迅速断头,取脑组织进行相关检查。Western blotting检测脑组织脑组织膜性结构中PKCa含量。 (2)观察3%氯化钠对IL-1β诱导的星形胶质细胞AQP4表达的影响：原代培养星形胶质细胞,培养至第四代后,第四代星形胶质细胞随机分为3大组：对照组(control组)、IL-1β组、IL-1β+HS组。实验结束后,进行相关检查。MTT法检测细胞存活率,Real-time RT-PCR检测星形胶质细胞AQP-4mRNA含量,FCM (PE直接标记抗体法)检测星形胶质细胞膜表面AQP-4含量。 (3)PKC抑制剂Calphostin C对3%氯化钠诱导的AQP4表达变化的影响：第四代星形胶质细胞随机分为6组：A.对照组(control组)；B.IL-1β组：C.IL-1β+HS组：D.IL-1β+抑制剂组；E.IL-1β+抑制剂+HS组。实验结束后,进行相关检查。Real-time RT-PCR检测星形胶质细胞AQP-4mRNA含量,FCM (PE直接标记抗体法)检测星形胶质细胞膜表面AQP-4含量。统计方法两样本均数比较采用t检验,多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析,P0.05认为有统计学意义。 3.2结果 (1) IL-1β组及IL-1β+HS组与对照组比较细胞存活率无统计学差异(P0.05)。 (2)脂多糖组脑组织膜性结构中PKCa含量无明显变化,与对照组比较无显著差异(P0.05)；3%氯化钠组治疗后6小时,脑组织膜性结构中PKCa含量明显增高,明显高于脂多糖组及对照组(P0.05)。 (3)用含IL-1β (5ng/mL)的培养基培养6小时后,星形胶质细胞AQP-4mRNA及蛋白含量明显增加,与对照组相比均有显著性差异(p0.01)。 (4) IL-1β+HS组星形胶质细胞AQP4mRNA含量低于IL-1β组,与IL-1β组比较有显著差异(p0.01)；星形胶质细胞AQP4蛋白含量变化规律与AQP4mRNA一致。 (5) PKCa抑制剂+HS组星形胶质细胞AQP-4mRNA含量明显高于IL-1β+HS组(p0.01),但仍低于IL-1β组(p0.01)；星形胶质细胞蛋白含量变化规律与AQP4mRNA一致。 3.3结论 (1)3%氯化钠可抑制IL-1β诱导的星形胶质细胞AQP4mRNA和蛋白表达。 (2)3%氯化钠可能通过激活PKC而抑制IL-1β诱导的星形胶质细胞AQP4mRNA和蛋白表达。结论 (1)腹腔注射脂多糖(10mg/kg)6小时后可诱导产生脑水肿,成功建立了稳定的脂多糖脑水肿模型；脂多糖所致脑水肿时血脑屏障通透性增高、脑组织细胞因子IL-1β和TNF-α的表达增加。 (2)3%氯化钠可减轻脂多糖诱导的小鼠脑水肿,下调脑水肿时脑组织炎症因子的表达和产生。 (3)3%氯化钠可抑制脂多糖诱导的小鼠脑水肿时脑组织AQP4的表达,减少炎症因子的表达和产生可能是3%氯化钠抑制AQP4表达的机制之一。 (4)3%氯化钠可抑制IL-1β诱导的星形胶质细胞AQP4mRNA和蛋白表达,激活PKC可能是3%氯化钠抑制AQP4表达的机制之一。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742

【参考文献】