阿曼托双黄酮通过调控炎症信号通路预防癫痫发生及神经保护作用研究

发布时间：2018-03-18 13:05

本文选题：阿曼托双黄酮　切入点：癫痫　出处：《宁夏医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：癫痫是常见的脑部疾病,以慢性反复自发性发作为特征,并常伴有情感和认知功能障碍。目前癫痫的治疗仍以药物治疗为主,经合理规范的抗痫药物治疗,有约20%~30%的患者发作仍得不到有效缓解,这类癫痫被称为难治性癫痫。颞叶癫痫是成人最常见的难治性癫痫,常继发于各种原始的脑损伤并诱导脑内级联事件发生,最终导致癫痫易感性增高并产生反复自发性癫痫发作,这一过程称为癫痫发生(epileptogenesis)。随着科学技术的发展癫痫发生的概念得到不断更新,越来越多的临床和实验证据证实,脑内炎症过程是癫痫发生的一个具有决定性的病理机制,它贯穿于癫痫发生的各个阶段,是其各种病理生理变化的一个共同背景,而最新的共识将癫痫发生定义为能够产生自发性癫痫发作症状后并且伴随脑组织生长发育的一种炎症反应过程。实验证据表明癫痫发生是一个动态过程,特别是在脑部癫痫易发区域,相关的分子结构和功能都会出现病理生理学上的持续变化,导致脑内新的病理环境的产生,最终诱发癫痫。虽然目前对于癫痫发生的预防和治疗仍存在较大争议,并且效果有待商榷,但是癫痫发生与炎症反应的关系及机制仍然是临床与基础研究关注的热点。阿曼托双黄酮(amentoflavone,AF)是具有多种生物活性的天然多酚类化合物,其在抗炎、抗微生物、抗氧化、抗肿瘤及神经保护等方面可以发挥重要作用。研究证实,AF能够通过抑制众多炎性因子而发挥抗炎作用。其在肿瘤细胞中通过抑制核因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)的活化来抑制肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)诱导的环氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)和前列腺素(Prostaglandins,PG)E2的表达,降低由NF-κB介导的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)生成一氧化氮(nitric oxide,NO)的能力;在溃疡性结肠炎模型中,AF预处理能够减轻结肠黏膜损伤,抑制脂质过氧化物、谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,显著降低NO、TNF-α、白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、i NOS以及COX-2的水平。在神经系统疾病中AF通过调节细胞因子如IL-1β和IL-6的表达来促进抗炎反应;AF能够显著下调COX-2蛋白表达水平,抑制重要炎症介质PGE2的合成;此外,AF能够通过干扰半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specificprotease,Caspase)活化来阻断细胞凋亡。因此,我们推测AF能够通过抑制调控癫痫发生时脑内炎症通路中的相关因子,降低神经元损伤预防癫痫的发生。本研究以氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型为基础,应用电生理、行为学、组织学和分子生物学等手段,验证如下假设:AF能够通过抑制胶质细胞激活、下调炎症通路中相关因子水平来调控脑内炎症反应,从而发挥神经保护作用,预防癫痫的发生。第一部分阿曼托双黄酮对氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠癫痫易感性和认知功能的影响目的:明确AF预处理对氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型癫痫易感性和认知功能的影响。方法:100只SD大鼠随机分为5组:AF预处理组(pre-AF组)、AF治疗组(AF组)、丙戊酸钠预处理组(pre-VPA组)、癫痫组(EP组)、空白对照组(Control组)。建立氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型,采用Racine评分评估癫痫模型的发作等级差异,脑电信号监测各组大鼠电生理变化,Morris水迷宫和Intelli Cage智能行为学检测分析系统评价大鼠学习记忆能力,客观评价AF预处理对致痫大鼠癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)和自发性发作易感性的影响,明确AF对致痫大鼠癫痫发生的预防作用。结果:pre-AF组在造模后少有癫痫发作,且发作等级明显降低,发作时间缩短,脑电信号显示癫痫样波出现的频率及波幅均明显降低,行为学和脑电信号表现与Control组相比无明显差异。Morris水迷宫定位航行试验中pre-AF组大鼠逃避潜伏期较AF组、pre-VPA组和EP组缩短(P0.05);在空间探索试验中,pre-AF组大鼠穿台次数比AF组、pre-VPA组和EP组显著增多(P0.05)。Intelli Cage行为学检测显示,鼻触学习测试中,与control组相比,pre-AF组、AF组、pre-VPA组、EP组的正确访问(visit)次数明显减少,差异有统计学意义(P0.05);与EP组相比,pre-AF组、AF组、pre-VPA组的正确访问次数明显增加,差异有统计学意义(P0.05),其中pre-AF组增加次数最明显;同时,对鼻戳(nosepoke)正确次数的观察中得到了结果与visit一致;在位置学习测试中,与control组相比,pre-AF组、AF组、pre-VPA组、EP组的正确访问次数明显减少,差异有统计学意义(P0.05);与EP组相比,pre-AF组、AF组、pre-VPA组的正确访问次数明显增加,差异有统计学意义(P0.05),其中pre-AF组增加次数最明显;位置逆转学习测试与位置学习测试结果相一致;在强化学习测试中,与control组相比,pre-AF组、AF组、pre-VPA组、EP组的正确鼻戳次数明显减少,差异有统计学意义(P0.05),与EP组相比,pre-AF组、AF组、pre-VPA组的正确鼻戳次数有明显改善(P0.05),其中pre-AF组改善最明显;强化逆转学习测试与强化学习测试结果相一致。结论:AF的预防性用药可以降低癫痫大鼠发作级别、缩短发作时间、改善空间学习记忆能力的下降,降低癫痫易感性。第二部分阿曼托双黄酮对氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠海马神经元损伤和氧化应激反应的影响目的:研究AF对氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠海马神经元损伤和氧化应激反应情况,明确其在预防癫痫发生过程中的作用及可能的机制。方法:雄性SD大鼠100只,分组同第一部分。建立氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型,应用Nissel染色及TUNEL染色观察癫痫大鼠海马神经元损伤和凋亡情况,免疫组化和Western-Blot技术检测大鼠海马凋亡相关蛋白caspase-3的分布和表达水平;同时检测各组大鼠海马中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、GSH水平以及过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性。结果:SE后72h,和control组相比,pre-AF组Nissel染色显示大鼠海马CA1区和CA3区存活的神经元数目无明显差异(P0.05)而较EP组明显增多(P0.05);与control组相比,pre-AF组TUNEL染色显示大鼠海马CA1区和CA3区的阳性细胞数目均无明显差异(P0.05),较EP组明显减少(P㩳0.05);免疫组化显示,与control组相比,pre-AF组大鼠海马CA1区和CA3区的caspase-3阳性细胞数目均无明显差异(P0.05),较EP组明显减少(P㩳0.05);Western Blot显示,pre-AF组与control组caspase-3蛋白表达量无显著差异(P0.05),而较其他各组均显著降低(P0.01)。对各组大鼠海马氧化应激指标检测显示,与control组相比,SE后24h和36h pre-AF组的GSH水平及SOD活力均无明显差异(P0.05),较EP组明显升高(P㩳0.05);而pre-AF组CAT、MDA和NO水平与control组相比无明显差异(P0.05),较EP组明显降低(P㩳0.05)。结论:AF预处理通过抑制海马氧化应激水平降低癫痫诱发的神经元损伤和凋亡,预防癫痫发生。第三部分阿曼托双黄酮对氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠神经胶质细胞激活和海马炎症反应的影响目的:研究AF对氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠神经胶质细胞激活和海马氧化应激反应的影响,进一步探讨其预防癫痫发生的机制及神经胶质细胞在癫痫发生过程中可能的作用。方法:雄性SD大鼠100只,分组同第一部分。建立氯化锂-匹罗卡品癫痫模型,应用免疫组化观察大鼠海马中Iba-1、GFAP的分布和表达,于SE后24h、48h、72h、96h提取大鼠海马组织,应用Western-Blot技术检测炎症通路中的关键因子NF-κB、COX-2蛋白表达变化,ELISA法检测下游炎性因子IL-1β、TNF-α、PGE2水平。结果:免疫组化显示,AF组、pre-VPA组及EP组大鼠海马CA1区、CA3区可见较多Iba-1阳性细胞,与control组差异有统计学意义(P0.05),而pre-AF组Iba-1阳性细胞数量增加明显减少,与control组相比无明显差异(P0.05);AF组、pre-VPA组及EP组大鼠海马CA1区、CA3区可见较多GFAP阳性细胞,与control组差异有统计学意义(P0.05);而pre-AF组GFAP阳性细胞数量增加明显减少,与control组相比无明显差异(P0.05);Western Blot显示,SE后24h、48h、72h、96h,与control组相比各组大鼠海马COX-2和NF-κB p65蛋白水平均有不同程度升高,其差异有统计学意义(P0.05),而与EP组相比,pre-AF组蛋白水平均显著降低,其差异有统计学意义(P0.05);除control组以外,各组COX-2和NF-κB p65蛋白表达在时间顺序上呈先高后低的变化趋势。SE后24h、48h、72h、96h,各组大鼠海马炎症因子IL-1β、PGE2和TNF-α水平均有不同程度升高,与control组相比其差异有统计学意义(P0.05),而与EP组相比,pre-AF组各炎症因子水平均显著降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论:AF能够通过抑制匹罗卡品诱导的癫痫大鼠海马COX-2和NF-κB p65的表达,降低IL-1β、TNF-α、PGE2水平,抑制小胶质细胞激活和星形胶质细胞的反应性增生发挥预防癫痫发和神经保护作用。
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【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.1

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