去泛素化酶USP22对恶性胶质瘤增殖、迁移、侵袭和干性的影响以及机制研究

发布时间：2018-03-24 03:28

本文选题：USP22　切入点：胶质瘤　出处：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：以成人多形性胶质母细胞瘤(GBM)为主要代表的恶性胶质瘤被认为是颅脑肿瘤中最常见的一种肿瘤类型。尽管近些年来对恶性胶质瘤采取了以手术为主,辅以放化疗的综合治疗策略,但是对患者的中位生存期并没有多大的延长,仅为14个月左右。恶性胶质瘤通常具有快速增殖、迁移、侵袭、易复发以及对放疗抵抗和化疗耐药等特点。针对恶性胶质瘤难治易复发的主要原因,目前肿瘤干细胞学说被大部分人所接受。即人们发现在恶性胶质瘤实体内部,存在着一小部分侧群细胞,被称为是胶质瘤干细胞(GSC),它们具有和神经干细胞相似的特点,比如能形成神经球,能进行自我更新以及能被诱导分化。常规的手术切除以及放化疗只能做到“治标”,即去除和消灭已分化的胶质瘤细胞,而对于具有放化疗抗性的胶质瘤干细胞侧群则缺乏明显的杀伤效果,因此这些干细胞可以继续进行不对称自我复制,引起肿瘤的复发。因此针对胶质瘤干细胞的研究对改善恶性胶质瘤的治疗现状具有重大的意义。近些年来,对胶质瘤干性的相关分子研究当中,多梳基因(polycomb genes)一直是热点所在。这些基因又能形成两个复合物,即以Bmi1为代表的多梳抑制复合物1(PRC1)和以Ezh2为主的多梳抑制复合物2(PRC2)。这些基因平时通过表观遗传修饰作用调控着众多下游基因的转录。正常情况下,干细胞的自我更新复制和分化过程是受到体内严格的控制的。多梳基因的的异常表达往往会引起抑癌基因的转录失常并引起某些干性相关信号通路的异常激活,促进肿瘤干细胞的形成和肿瘤的发展。值得注意的是,2005年由Glinsky带领的实验团队发现了一个由11个基因所组成的“death-from-cancer”的基因谱,这些基因被认为肿瘤的干性密切相关,对人类常见的绝大多数恶性肿瘤的侵袭,转移以及预后都具有重要的预测价值。而这其中就有多梳基因Bmi1和最近才被定义为肿瘤干性相关分子的去泛素化酶USP22。作为去泛素化酶(Dub)家族中最大的去泛素化特异蛋白水解酶(USP)亚族的成员之一,USP22对细胞的增殖、迁移、侵袭以及免疫环境都起着重要的调节作用。在转录调控机制上,USP22能参与基因的表观遗传修饰。一方面USP22属于SAGA转录复合物的成员,能参与靶基因的去乙酰化转录调控。另一方面,USP22可以直接使组蛋白ub H2A和ub H2B去泛素化,从而调节靶基因的转录。在翻译后修饰的调控上,USP22可以水解目标蛋白的泛素化标签,避免其蛋白水解,提高目标蛋白的稳定性。目前已经发现的底物蛋白有SIRT1、TBP1,FUBP1和RCAN1等。研究发现,USP22在许多恶性肿瘤中都处于高表达,如胃癌、结肠癌、前列腺癌等,并能促进肿瘤的增殖、侵袭、转移,抑制肿瘤细胞的凋亡。研究发现,USP22在不同的肿瘤中能参与多个促癌信号通路的调控,如JAK-STAT信号通路,雄激素受体(AR)信号通路,局部黏附激酶(FAK)信号通路以及由Bmi1介导的INK4a/ARF和AKT信号通路。目前已有个别报道表明相比于正常脑组织,USP22在胶质瘤中的表达更高,且蛋白表达水平与肿瘤的级别呈正相关以及和患者的存活时间呈负相关。在胶质瘤细胞中,敲减USP22能导致细胞有丝分裂G1/S期的阻滞以及促进细胞的凋亡,但是除了影响细胞周期和细胞凋亡外,USP22能否影响胶质瘤细胞的其他恶性生物学行为,如增殖、迁移和侵袭目前尚不清楚。尤其是作为肿瘤干性相关标记物,USP22能否影响胶质瘤的干性更值得去研究。而作为去泛素化酶,USP22的促癌作用无疑与其对下游一系列底物癌蛋白的稳定密切相关。因此,USP22对于肿瘤干性的维持很大程度上也与其对干性基因相关蛋白的稳定有关。而作为“death-from-cancer”的基因谱的主导成员,Bmi1对许多基因都能起到表观遗传修饰的作用,从而调控下游基因的表达。在胶质瘤中,已经有研究证明Bmi1处于高表达水平,它不仅能促进已分化的胶质瘤细胞的恶性生物学行为,降低放化疗敏感性,而且更重要的是它还能维持胶质瘤干细胞的存活和自我更新复制,抑制胶质瘤干细胞的凋亡和避免免疫系统的攻击。而敲除Bmi1能显著降低恶性胶质瘤细胞的克隆形成以及致瘤能力。因此降低恶性胶质瘤中Bmi1的水平,对消灭胶质瘤干细胞具有重大的意义。而已有相关研究表明,Bmi1在体内是一种半衰期较短的小分子蛋白,其翻译后水平受到由E3泛素连接酶介导的蛋白降解途径的调控。已有研究发现E3泛素连接酶β-Trcp以及Spop均能使Bmi1泛素化从而影响其表达水平。鉴于在体内,泛素化和去泛素化是两个相互拮抗的过程,因此Bmi1在肿瘤中蛋白水平的高表达很大程度上依赖于去泛素化酶的稳定作用,因此探寻在恶性胶质瘤中稳定Bmi1的去泛素化酶就至关重要。已有研究发现在不少恶性肿瘤中去泛素化酶USP22与Bmi1经常共同处于高表达状态,尤其在胃癌中还发现两者的表达水平呈正相关,在结肠癌以及非小细胞肺癌中也有USP22调控Bmi1表达的报道,进一步提示两者之间的紧密关系。通过查阅Human protein atlas数据库,我们同样发现USP22与Bmi1在恶性胶质瘤中也处于共同高表达。鉴于目前在胶质瘤中,Bmi1高表达水平机制并不明确。我们基于上述种种事实,提出了我们的假设,即在胶质瘤中Bmi1的高表达可能是由USP22的去泛素化稳定机制介导的,而USP22对于胶质瘤干性的影响也与其对Bmi1的稳定密切相关。本文章中可分为五个部分。第一部分我们通过30例来自我院的不同级别的胶质瘤标本(WHO II级和WHO IV级各15例)中对USP22的免疫组化以及结合Human protein atlas数据库分析,再次验证了在USP22的蛋白表达在正常脑组织中、低级别胶质瘤以及高级别胶质瘤中逐渐升高,生存分析发现USP22高表达提示胶质瘤预后不良。第二部分我们以U251恶性胶质瘤细胞为研究对象,对USP22的生物学功能进行了相关的研究,在体外实验中发现敲减USP22能减慢U251细胞的增殖,迁移以及侵袭能力。鉴于USP22被认为与肿瘤干性相关,因此第三部分我们以在干细胞培养液中对U251、U87以及GBM-HSF三种胶质母细胞瘤细胞系进行转干培养,以成球能力作为判断肿瘤干性的指标,着重对USP22是否能影响胶质瘤肿瘤干性进行了研究。我们发现敲除USP22以后,上述三种胶质瘤干细胞的成球能力均有减弱。利用荧光定量PCR来检测在贴壁和成球两种条件下胶质瘤细胞中干性基因的表达变化,发现USP22的敲除会引起多个干性基因的转录水平降低。利用western blot蛋白印迹法检测在贴壁和成球两种培养条件下USP22的表达差异,发现在U251细胞中,成球状态下USP22的表达量明显高于贴壁状态下的表达。第四部分我们对USP22影响胶质瘤恶性生物学行为尤其是肿瘤干性的机制进行了研究。为了验证我们前面的推断,我们着重针对USP22与Bmi1之间的表达以及调控关系进行了探索。首先通过对30例不同级别的胶质瘤组织切片进行免疫组化,我们发现USP22与Bmi1共定位在细胞核,与低级别胶质瘤中相比两者的表达在高级别胶质瘤中更高,且在同一个肿瘤组织中两者的表达水平呈现出较强的正相关性。在HEK293FT和U251细胞中进行免疫荧光检测,发现USP22与Bmi1在细胞核中分布具有很强的重叠性,且通过免疫荧光强度也可以看出两者的表达水平呈现一定程度的正相关。接着我们再次验证了Bmi1的蛋白水平受泛素化途径调控。通过免疫共沉淀和免疫印迹的方法发现在HEK293FT细胞中外源性过表达的USP22能与Bmi1直接结合相互作用,从而稳定Bmi1的蛋白水平,并且这是以来USP22的去泛素化酶活性的。而在内源性胶质瘤细胞中,敲除USP22后,Bmi1的转录水平有所升高,而蛋白水平却呈现下降趋势,也间接说明了USP22在蛋白水平上对Bmi1起到了稳定的作用。而敲减Bmi1的表达后,USP22的转录水平显著上升,说明Bmi1可能参与USP22的转录抑制。最后鉴于PRC复合物对肿瘤干性影响的普遍性和重要性以及Bmi1是PRC1复合物的成员分子,我们同时对PRC2复合物的一些成员进行了免疫印迹蛋白水平的检测,发现在U251细胞中,内源性USP22敲减后PRC2复合物相关成员Ezh2,Suz12与H3K27me3的表达均无明显变化。第五部分对USP22和Bmi1影响胶质瘤细胞干性的具体下游分子机制进行了初步探究,通过相关基因芯片分析并挑选基因进行验证后发现,USP22和Bmi1能共同调控许多下游靶基因的转录,这些靶基因很多都与细胞外基质、神经内分泌以及细胞发育有关。第一部分USP22在人脑胶质瘤中的表达和预后研究目的:再次通过我院的临床胶质瘤标本结合权威肿瘤分子生物学信息库数据验证USP22在胶质瘤中的高表达水平,并研究USP22水平对患者生存期的影响,突出USP22在胶质瘤中的致癌性。方法:通过在长征医院神经外科收集的30例不同级别的胶质瘤组织石蜡切片(WHO II级和WHO IV级各15例)以及5例正常脑组织中对USP22进行免疫组化染色,比较高级别胶质瘤、低级别胶质瘤以及正常脑组织中USP22的表达水平差异。通过在Human protein atlas权威肿瘤数据库(http://www.proteinatlas.org/)中查询USP22的相关蛋白表达信息来进一步验证实验结的可靠性。结合随访资料对患者总生存期进行生存分析,明确USP22与患者预后的关系。结果:通过30例不同级别的胶质瘤以及5例正常脑组织中对USP22的免疫组化的结果分析,发现USP22的蛋白表达在正常脑组织中、低级别胶质瘤以及高级别胶质瘤中逐渐升高,这与Human protein atlas上的结果一致。USP22高表达提示患者的预后不良。结论:USP22在胶质瘤中高表达,且随着肿瘤恶性程度增高而表达增高,其高表达提示患者的预后不良,提示USP22与胶质瘤的恶性生物学行为密切相关。第二部分USP22对恶性胶质瘤U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响目的:研究USP22对U251胶质瘤细胞的恶性生物学行为的影响。方法:我们分别构建了两条USP22sh RNA慢病毒感染U251细胞株。并利用western blot蛋白印迹法验证了这两条sh RNA的有效性。随后我们利用WST-1法检测U251细胞的增殖能力并绘制了增殖曲线,分别在24h、48h以及72h三个时间点和阴性对照组做了增殖能力的比较。利用Wound healing划痕实验检测了U251细胞的迁移能力,并分别在18h和36h和阴性对照组做了迁移能力的比较。利用Transwell实验检测了U251的侵袭能力,并在72h和阴性对照组做了侵袭能力的比较。结果:在U251细胞中当USP22表达被抑制后,在第一个24h内三组细胞的增殖速度无明显统计学差异,但是随着时间的推移,在48h和72h两个时间点USP22sh RNA慢病毒感染组U251的细胞增殖速度明显减慢,和阴性对照组之间有显著的统计学差异(p0.001)。当USP22被敲除后,我们在划线后18h和36h分别对两组细胞的迁移距离进行了测量,发现USP22sh RNA慢病毒感染的U251细胞的迁移速度在这两个时间点上与阴性对照细胞相比均有明显的减慢,且差异具有显著的统计学意义(p0.001)。利用Transwell实验检测了U251的侵袭能力,并在72h和阴性对照组做了侵袭能力的比较,发现USP22sh RNA慢病毒感染的U251细胞的侵袭能力明显减弱,且差异具有显著的统计学意义(p0.001)。结论:USP22对维持U251胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为有重要的作用。第三部分USP22对恶性胶质瘤细胞干性的影响目的:以成球能力作为肿瘤干性能力的指标,探究USP22在不同胶质瘤细胞系中对肿瘤干性的影响。方法:我们在U251和U87细胞中,构建了稳定表达慢病毒USP22sh RNA的细胞系,在GBM-HSF细胞中构建了可调控的USP22sh RNA表达系统,并利用荧光定量PCR和western blot蛋白印迹技术对sh RNA的干扰效率以及可诱导USP22sh RNA表达系统的有效性进行了验证。在无血清干细胞培养液中,对U251、U87和GBM-HSF细胞进行干细胞成球培养,通过统计分析研究USP22对三种细胞系干细胞成球的影响。利用荧光定量PCR来检测在贴壁和成球两种条件下胶质瘤细胞中干性基因的表达变化。利用western blot蛋白印迹法检测在贴壁和成球两种培养条件下USP22的表达差异。结果:在U251和U87细胞中USP22sh RNA的效率理想,在GBM-HSF细胞中,经过强力霉素Dox处理后,USP22的m RNA水平下降了约75%,蛋白表达水品也明显减少。在无血清的干细胞培养液中将贴壁的U251、U87和GBM-HSF转干培养后,三种细胞均具有成球的能力。在这三种细胞系中,USP22的表达抑制均导致了细胞成球直径的减小,且有统计学差异(p0.001)。我们在贴壁的U251细胞以及成球的GBM-HSF细胞中进行了相关干性基因的检测,均发现USP22的内源性表达抑制会引起部分干性基因的转录水平的下降。通过western blot免疫印迹法在转干前后两种状态下的U251中进行了USP22蛋白水平的检测,发现在干细胞培养条件下,USP22的蛋白水平较在分化培养条件下要明显增高。结论:1.USP22是胶质瘤干细胞的标记物之一,在胶质瘤干细胞中有更高的表达。2.USP22对恶性胶质瘤细胞的干性起着重要的维持作用,具体机制和影响干性基因的转录水平有一定的关系。第四部分USP22影响胶质瘤恶性生物学行为的机制研究目的:研究USP22影响胶质瘤恶性生物学行为的机制并重点探索USP22与Bmi1之间的表达以及调控关系。方法:通过在长征医院神经外科收集的30例不同级别的胶质瘤组织石蜡切片(WHO II级和WHO IV级各15例)中分别对USP22和Bmi1进行免疫组化染色,并根据染色深度以及染色面积等指标计算出总的表达强度。通过Graphpad Prism软件来分析计算在同一个肿瘤组织中两者之间在表达上的相关性。在HEK293FT细胞中同时过表达外源性USP22与Bmi1,并利用免疫荧光染色来观察USP22与Bmi1在亚细胞定位分布以及表达上的关系;在U251细胞中,利用免疫荧光染色来观察内源性USP22与Bmi1在亚细胞定位以及表达水平上的关系。在HEK293FT细胞中过表达了外源性GFP-Bmi1质粒,用western蛋白印迹法检测经蛋白酶体抑制剂处理后,外源性Bmi1的蛋白水平变化。在HEK293FT细胞中分别同时外源性共转染Bmi1和USP22野生型/酶活性突变型,用western蛋白印迹法检测外源性USP22对Bmi1的蛋白水平的影响。在敲减USP22的U251细胞中,运用荧光定量PCR和免疫印迹的方法分别检测Bmi1的转录水平和蛋白水平。运用免疫共沉淀的方法在HEK293FT细胞中检测USP22与Bmi1的直接相互作用。在U251细胞中,运用实时荧光定量PCR法检测Bmi1对USP22的转录水平的影响。最后鉴于PRC复合物对肿瘤干性影响的普遍性和重要性以及Bmi1是PRC1复合物的成员分子,我们同时对PRC2复合物的一些成员进行了免疫印迹蛋白水平的检测。结果:通过30例子不同级别的胶质瘤中对USP22与Bmi1的免疫组化的结果分析,发现两者的表达相较于低级别胶质瘤,在高级别胶质母细胞瘤中的表达更高,且在同一个肿瘤组织中两者的表达水平具有较强的正相关性。我们通过在HEK293FT细胞中同时过表达外源性USP22与Bmi1以及在U251细胞中,利用免疫荧光染色来分别观察外源性和内源性USP22与Bmi1在亚细胞定位分布以及表达水平上的相关性。发现USP22与Bmi1在细胞核中分布具有很强的重叠性,且通过免疫荧光强度也可以看出两者的表达水平呈现一定程度的正相关。在HEK293FT细胞中验证了Bmi1的蛋白水平受泛素化水平的影响。并发现外源性过表达野生型的Flag-USP22能增加GFP-Bmi1的表达,而过表达Flag-USP22C185S酶活性突变体不影响Bmi1的蛋白水平。在U251细胞中,USP22的内源性表达抑制会引起内源性Bmi1的转录水平的明显上升,而Bmi1的蛋白水平却有不同程度的下降趋势,尤以慢病毒干扰效率较强的USP22sh RNA1组明显。在HEK293FT细胞中通过免疫共沉淀的方法发现外源性过表达野生型的Flag-USP22可以与外源性GFP-Bmi1直接相互作用,而过表达Flag-USP22C185S酶活性突变体不能直接结合GFP-Bmi1。在U251细胞中利用慢病毒干扰抑制Bmi1的内源性表达受后,发现USP22的转录水平有明显的上升。最后免疫印迹法发现在U251细胞中,内源性USP22敲减后PRC2复合物相关成员Ezh2,Suz2与H3K27me3的表达均无明显变化。结论:1.USP22与Bmi1共同定位于细胞核,且在亚细胞定位层面的分布拟合度高。2.与低级别胶质瘤相比较,USP22与Bmi1在胶质母细胞瘤中的表达水平明显升高。不仅在胶质瘤临床组织中,而且在胶质瘤细胞中,USP22与Bmi1的表达水平存在一定的正相关性。3.Bmi1的蛋白稳定性确实受到泛素化水平的调控。4.在无转录影响的干扰下,USP22能稳定Bmi1的蛋白水平,且这种稳定作用是通过两者的直接作用而实现的,与USP22的去泛素化酶活性位点紧密相关。5.在U251细胞中,内源性的USP22一方面能抑制Bmi1的转录水平,另一方面又能维持Bmi1蛋白稳定性。6.在U251细胞中USP22与Bmi1表达的正相关性无法用Bmi1对USP22的转录调控来解释。7.在U251细胞中,PRC2复合物不参与USP22对胶质瘤恶性生物学行为的调节。第五部分USP22和Bmi1共同影响胶质瘤细胞干性的分子机制的初步探讨目的:研究受USP22与Bmi1共同影响的基因谱与胶质瘤干性的关系。方法:在感染USP22sh RNA1、Bmi1sh RNA以及阴性对照的U251细胞中用Agilent表达谱基因芯片来分析并找出共同受USP22和Bmi1影响的基因,分析这些基因所富集的相关信号通路。在以上这些基因中,通过查找Pubmed文献数据库并用Excel软件进一步筛选出在胶质瘤中有较明确的生物学功能的基因,并随机挑选了8个基因用实时荧光定量RCR法验证芯片结果。结果:与阴性对照组相比,USP22与Bmi1的内源性表达抑制后,各自有2151和1488个基因转录水平发生了2倍以上的改变,且其中有413个基因是受两者共同影响的。通过相关富集和信号通路分析发现这413个基因主要与细胞外基质、神经内分泌、免疫调节以及细胞分化等信号通路有关。我们对胶质瘤中有较明确的生物学功能的基因进行了遴选,发现这些基因参与的生物学功能基本与上述的几个通路是相符合的。在这些基因中,我们随机选择了8个基因,发现这些基因中大部分都与胶质瘤细胞的干性维持有关。芯片分析结果显示这8个基因在USP22和Bmi1表达水平受到干扰后,转录水平均有不同程度的下降,并用荧光定量PCR对芯片结果进行了验证,发现与芯片结果是一致的。结论:1.在胶质瘤细胞中,USP22与Bmi1各自都直接或间接地影响着许多基因的表达,而其中有不少比例的基因受到两者的共同影响,也从一个侧面验证了USP22与Bmi1在转录调控上的高相关性。2.受USP22与Bmi1共同影响的基因中,大部分与细胞外基质,神经内分泌,免疫以及细胞分化等相关通路有关。3.通过对芯片结果验证,USP22与Bmi1对许多干性相关基因的转录水平有维持作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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