同型半胱氨酸对体外分离培养神经干细胞及大鼠梗塞大脑皮质区自噬作用研究

发布时间：2018-03-25 21:04

本文选题：同型半胱氨酸　切入点：神经元　出处：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的通过建立SD大鼠大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO)模型,观察同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经细胞损伤及凋亡的影响,通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)和Hcy干预探讨Hcy对缺血脑组织损伤的作用机制;通过体外培养原代神经干细胞(neural stem cells,NSCs),观察Hcy对NSCs增殖及损伤的影响,通过Hcy干预及基因表达谱芯片方法探讨Hcy对NSCs增殖及损伤的作用机制。该课题旨在探讨高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)对梗塞大脑的损伤机制,为脑梗塞疾病的预防及治疗提供新的思路。方法1.80只成年雄性SD大鼠随机分为4组,分别为假手术组(sham operation,SHAM组)、大脑中动脉栓塞再灌注模型组(MCAO组)、模型+同型半胱氨酸组(MCAO+Hcy组)和模型+同型半胱氨酸+3-甲基腺嘌呤组(MCAO+Hcy+3MA组),每组20只。Hcy干预按4 m L/kg标准隔天尾静脉注射0.8 mg/m L Hcy溶液,每周称量一次体重,根据体重调整干预剂量。预干预21 d后建立MCAO模型。造模前5 d MCAO+Hcy+3MA组每天尾静脉注射3MA(5 mmol/L,4 m L/kg·d)。MCAO手术后72 h HE染色观察脑组织病理改变,TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,采用酶循环法检测大鼠血浆中Hcy浓度,透射电镜观察脑组织细胞损伤及自噬情况,免疫印迹法(Western Blot,WB)检测不同组别大鼠脑组织中的自噬标记蛋白LC3B和Beclin-1的表达情况,免疫荧光标记法(immunofluorescence,IF)检测脑组织细胞中LC3B和Beclin-1的表达及分布情况。2.取24 h内新生SD大鼠大脑分离神经干细胞(NSCs)进行原代培养。将细胞随机分成2组:正常对照组(Control组)、Hcy组(培养液中添加Hcy 150μmol/L)。免疫印迹法检测NSCs自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、m TOR、p70S6K表达情况,电镜观察NSCs损伤及自噬情况,Agilent Sure Print G3 Rat GE(8*60K,Design ID:028279)基因表达谱芯片检测NSCs基因表达谱变化,免疫印迹法验证基因芯片结果。结果1.酶循环法检测大鼠血浆发现Hcy干预组大鼠血浆Hcy浓度显著升高。HE染色发现SHAM组脑组织细胞形态正常,MCAO后细胞出现明显损伤,与MCAO组比,MCAO+Hcy组细胞损伤更为严重,MCAO+Hcy+3MA组大鼠脑组织细胞损伤程度比MCAO+Hcy组轻。TUNEL染色结果显示MCAO组神经细胞凋亡率较SHAM组高(P0.05),而MCAO+HCY组细胞凋亡程度比MCAO组更严重(P0.05)。与MCAO+HCY组相比,MCAO+HCY+3MA组凋亡率显著下降(P0.05)。电镜下观察脑组织切片发现MCAO组细胞出现显著损伤,有少量自噬小体产生,与MCAO组相比,MCAO+Hcy组脑组织细胞损伤程度更严重,镜下可见更多的自噬小体。Western Blot检测结果显示:与SHAM组相比,MCAO组LC3B、Beclin-1表达上调,MCAO+HCY组LC3B、Beclin-1表达较MCAO组进一步上调,而与MCAO+HCY组相比,MCAO+Hcy+3MA组LC3B、Beclin-1表达下调,差异均有统计学意义(P0.05)。免疫荧光结果显示:LC3B(或Beclin-1)主要在皮质缺血半暗带的神经元胞浆中表达,不在星形胶质细胞中表达。MCAO组8-OHd G阳性细胞显著多于SHAM组(P0.05)。与MCAO组比较,MCAO+Hcy组8-OHd G阳性细胞显著增加(P0.05)。MCAO+Hcy+3MA组8-OHd G阳性细胞少于MCAO+Hcy组(P0.05)。2.本实验成功地从新生SD大鼠大脑中分离NSCs进行培养并用Hcy干预,Western Blot检测结果发现:Hcy干预后NSCs LC3-II与LC3-I比值升高、Beclin-1表达上调,差异有统计学意义(P0.05)。电镜观察结果表明:Hcy干预后细胞损伤严重,细胞内产生了很多自噬小体和自噬溶酶体。采用基因表达谱芯片对细胞m RNA的表达情况进行研究,筛选出干预后发生变异的基因457种并进行GO、pathway等相关分析,结果表明Hcy广泛影响了细胞内的多种生理、病理活动,特别是突触囊泡循环、萜类化合物的生物合成、Rap1信号通路、抗生素的生物合成、丁酸代谢、甲状腺癌、上皮细胞细菌侵入、缝隙连接等通路,其中包括m TOR通路。WB结果也验证了Hcy对m TOR通路蛋白m TOR、p70S6K的影响。结论本实验成功建立大鼠大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO)模型,发现Hcy加剧了缺血再灌注后神经细胞的损伤,激活了自噬,而抑制自噬能显著改善Hcy导致的自噬损伤。本研究提示Hcy可能通过激活自噬导致了脑组织的损伤。我们还发现Hcy导致的LC3B和Beclin-1的表达增加主要发生于皮层的神经元,在星形胶质细胞中几乎没有表达。说明Hcy可能通过神经元内自噬的激活造成脑组织的损伤。此外,Hcy干预后8-OHd G水平上调,故Hcy导致了脑缺血后皮质神经元自噬的过度激活,而氧化应激可能是其中的一个机制。本实验成功分离新生SD大鼠NSCs进行培养。Hcy干预结果显示:Hcy增加了NSCs的损伤和细胞内自噬水平,自噬小体增加,LC3-II/LC3-I的比值升高,Beclin-1蛋白表达增加。说明Hcy干预可能通过激活自噬造成NSCs损伤。NSCs基因芯片及WB结果显示Hcy干预影响了m TOR通路。提示Hcy干预可能通过m TOR通路激活自噬造成NSCs损伤。综上两部分结果,我们得出结论——Hcy可以通过m TOR通路激活NSCs自噬,通过ROS途径激活脑组织神经元的自噬,造成神经干细胞和神经元的损伤。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

【参考文献】