4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（ATPR）对人脑胶质瘤细胞株U87诱导分化的研究

发布时间：2018-03-27 07:01

本文选题：胶质瘤　切入点：增殖　出处：《南京医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的胶质瘤是成人颅内最多见、治疗最棘手的原发性肿瘤,其发病率占颅内肿瘤的35.26%～60.96%。虽然近几十年来随着手术、放疗、化疗等治疗技术的发展,脑胶质瘤的治疗取得了长足的进步,但是总体预后较以前并没有显著改善。积极寻求新的针对胶质瘤的治疗方式意义重大,近年来,药物诱导肿瘤细胞向正常细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡的治疗理念由于不同于传统的直接杀伤治疗策略而受到普遍关注,并陆续发现多种具有诱导分化作用的药物。4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)是近来新合成的一种全反式维甲酸衍生物,具有很好的诱导肿瘤细胞分化的效果,本研究应用ATPR体外诱导人脑U87胶质瘤细胞,并通过不同的方法检测其抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭性、诱导其分化及促进凋亡的作用,为神经胶质瘤的诱导分化治疗提供实验依据并寻找合适的诱导分化剂。方法将U87细胞随机分成空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和实验组,空白对照组、阴性对照组和阳性对照组分别加入PRMI-1640细胞培养基、含二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)的PRMI-1640细胞培养基和2mmol/L的苯丁酸钠(Sodium phenylbutyrate, SPB)处理,实验组加入不同浓度的ATPR(终浓度分别为1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8和1×10-9mol/L)处理后,以CCK-8(Cell Counting Kit8,CCK-8)法及平板克隆形成实验分析细胞增殖；Transwell法检测各组细胞侵袭性变化；Tunnel法检测各组细胞凋亡情况,分别在光学显微镜和电子显微镜下观察细胞形态的改变；蛋白质印迹法检测分化指标胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达；流式检测对细胞周期分布的影响。结果1、ATPR抑制U87细胞增殖：1.1CCK-8法做细胞生长曲线显示阴性对照组和空白组细胞生长旺盛,阳性对照组与各剂量ATPR组能够抑制U87细胞增殖,明显的抑制效应出现在72h后,而且,随ATPR浓度的增加,抑制程度越明显,提示抑制效应呈浓度相关性,72h药物作用IC50=1.75×10-*5mol/L。1.2平板克隆形成实验结果显示阳性对照组及10-5、10-6mol/L ATPR组细胞散在分布,未能形成有效克隆,10-7、10-8、10-9mol/LATPR组克隆形成率分别为(4.97±1.22)%、(17.65±5.17)%、(26.24±3.65)%,低于空白组(43.26±8.81)%,差异有统计学意义(t=7.458、4.341、3.091,P0.05),而阴性对照组(33.26±5.40)%与空白组间无明显差异(t=1.676,P0.05)； 2、ATPR降低U87细胞侵袭性：经ATPR处理72小时的U87细胞侵袭性下降,Transwell实验结果显示,阳性对照组与1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L ATPR组细胞侵袭力下降,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05),而1×10-9mol/L ATPR及阴性对照组细胞侵袭性未见明显下降(P0.05),提示ATPR能够有效降低U87细胞侵袭性。 3、ATPR促进U87细胞凋亡：经ATPR处理72小时的U87细胞凋亡增加,Tunnel实验结果显示,阳性对照组与1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L ATPR组细胞凋亡数增加,且随着ATPR浓度的升高,凋亡趋势越明显,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05),而1×10-9mol/L ATPR及阴性对照组细胞凋亡情况未见明显改变,与空白组相比,差异无统计学意义(P0.05),提示ATPR能够促进U87细胞凋亡。 4、ATPR阻滞U87细胞周期的进展：阳性对照组与1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/LATPR组处于G1/Go期细胞比例较空白对照组升高(t=8.339、5.942、4.473、2.864,P0.05),而处于DNA合成旺盛的S期细胞比例降低(t=9.946、7.209、4.627、2.868,P0.05),ATPR能够引起U87细胞周期进展障碍,使细胞阻滞在G1/G0期,减少进入DNA合成期细胞比例。 5、ATPR对U87细胞形态学的影响：光学显微镜下观察结果显示,细胞形态学改变,空白对照组和阴性对照组中U87细胞的形态相似,细胞体积及细胞核均较大,细胞核/质比较高,细胞突起少；ATPR处理后,U87细胞形态呈成熟化,表现为细胞体积及细胞核缩小,突起不同程度增多,细胞核/质比减小。且随着ATPR浓度升高,细胞成熟趋势越明显。然而1×10-6mol/L组与阳性对照组形态相似,成熟化程度超过1×10-5mol/L组,电子显微镜下观察结果显示,空白和阴性对照组胞核较大,细胞器少,而阳性对照组和ATPR组细胞体积及细胞核较小,细胞突起不同程度增多,细胞器丰富,可见多量线粒体和内质网等,其中1×10-5mol/L ATPR组可见多量肿胀的线粒体。 6、ATPR促使U87细胞GFAP表达增强：蛋白质印迹法检测结果显示,阳性对照组和高浓度ATPR组GFAP蛋白的表达上调,表现为条带加深、变宽。结果显示SPB、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L ATPR组GFAP表达量均高于空白对照组,而10"9mol/L组与空白组差异不明显。结论1、ATPR能够有效抑制U87细胞的增殖、促进其凋亡并降低其侵袭性；2、ATPR能够阻滞U87细胞周期向前进展,上调GFAP表达,促进细胞形态成熟化；3、ATPR有望成为神经胶质瘤合适的诱导分化剂,为其临床治疗脑胶质瘤带来新的希望。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4

【参考文献】