实验性自身免疫性脑脊髓膜炎小鼠中枢神经系统中IL-27对CCL5表达的影响

发布时间：2018-03-29 08:58

  本文选题：IL-27　切入点：CCL5　出处：《重庆医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：背景与目的：多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统（Central nervous system，CNS）自身免疫性疾病，炎症反应在其疾病发生和发展过程中起着重要的作用。白细胞介素-27（Interleukin-27，IL-27）是近年来新发现的IL-12家族成员之一，主要由激活的抗原递呈细胞APC、巨噬细胞和树突状细胞DCs分泌产生。自IL-27被发现以来，已显示出在免疫反应调控中的独特作用：诱导Th1细胞的分化，抑制Th2细胞和Th17细胞的发育；在高度Th1细胞极化时，IL-27的主要作用是限制Th1型免疫反应的强度和持续时间，从而保护机体免受过度的免疫反应的损伤，同时具有促炎与抗炎的双重特征。炎症性趋化因子5（RANTES/CCL5）是T淋巴细胞产生的炎性趋化因子之一，可以诱导白细胞粘附并穿过血脑屏障（Blood-brainbarrier，BBB）进入CNS，从而引起一系列的炎症反应和继发病变。研究发现，在缓解-复发型MS中，抑制CCL5的表达可以预防疾病的复发。目前，有很多国内外研究及报道提示，在自身免疫性炎症性疾病中，机体内IL-27和CCL5存在一定的相关性，但目前并无其具体机制的相关研究及报道。本实验通过在体实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune cerebrospinal meningitis，EAE）模型和离体培养腹腔巨噬细胞探索CCL5在EAE病变进程中受IL-27的变化调控的影响，并探索其机制，为预防MS的疾病进展和复发提供临床指导。 方法： 第一部分：将40只健康雌性C57BL/6小鼠用MOG31-55多肽免疫后0d、7d、15d、21d（每组10只），每天测其体重并观察老鼠行为学变化，用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）观察小鼠CNS中的炎症情况；用Western bloting（WB）和免疫组织化学方法测量IL-27和CCL5在中枢神经系统的表达。将50只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、EAE组、IL-27+EAE组、SC144（IL-27受体拮抗剂）+EAE组、PBS（磷酸缓冲液）+EAE组，用WB和PCR方法测量CCL5的表达量。 第二部分：用3%巯基乙酸盐（每只1毫升）腹腔注射C57BL/6小鼠3d后，取小鼠腹腔巨噬细胞。分别对原代小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞株进行培养，加入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）炎性刺激因子诱导mCCL5的表达，加入重组IL-27和SC144进行干预调控，收取细胞用realtime PCR测定CCL5mRNA的表达量及半衰期，用WB测量IFN-γ和NF-κB的蛋白表达；收取细胞培养液，用ELISA测定CCL5的表达量。 结果： 1、EAE小鼠最早在免疫后12天开始发病，大多数均集中在14～18天发病，并于2～4天后达到疾病高峰，在发病高峰期时神经功能评分均数为2.38±0.52。 2、HE染色示正常组小鼠脊髓无明显炎性细胞浸润；模型组炎性细胞浸润明显，血管周围有明显炎性细胞浸润，呈典型“血管袖套样”改变，且实质内亦有明显炎症细胞浸润，浸润的细胞类型以淋巴细胞为主，也可见少量胶质细胞。 3、在EAE疾病的过程中，EAE小鼠脑白质中IL-27的表达量逐渐增高；而CCL5的表达量先升高后降低。与EAE模型组和对照组相比，IL-27干预组神经功能评分明显较降低，疾病高峰期相对延后，CCL5表达水平明显受到抑制（P0.05）；SC144干预组神经功能评分明显较高，疾病高峰期相对提前，CCL5表达水平明显升高（P0.05）。 4、在细胞水平，与正常对照组相比，LPS组、LPS+IL-27刺激组、LPS+SC144+IL-27组CCL5的表达均增多；与LPS刺激组和LPS+SC144+IL-27组比较，LPS+IL-27刺激组CCL5mRNA表达明显下降（P0.05），CCL5mRNA的半衰期缩短（P0.05）。 5、与正常对照组相比， LPS组、 LPS+IL-27刺激组、LPS+SC144+IL-27组IFN-γ和NF-κB的表达均增多（P0.05）；与LPS刺激组和LPS+SC144+IL-27组比较，LPS+IL-27刺激组IFN-γ和NF-κB表达明显下降（P0.05）。 结论：在小鼠自身免疫性脑脊髓膜炎疾病进展期，IL-27加速CCL5mRNA的半衰期，从而在mRNA和蛋白水平抑制CCL5的表达，并发挥抗炎作用，其具体机制至少部分是基于抑制IFN-γ的表达实现的。鉴于CCL5诱导白细胞粘附并穿过血脑屏障进入CNS引起一系列的炎症反应和继发病变，，干预IL-27的表达为抑制多发性硬化MS疾病进展并预防疾病复发提供新的临床指导。
[Abstract]:Background and objective: multiple sclerosis (Multiple sclerosis MS) is a central nervous system (Central nervous system, CNS) autoimmune diseases, inflammatory reaction in the disease occurrence and development plays an important role in the process. Interleukin -27 (Interleukin-27, IL-27) is a member of IL-12 family in recent years, mainly by activated antigen-presenting cells APC, secreted by macrophages and dendritic cells DCs. Since IL-27 was discovered, has demonstrated the unique role in immune response regulation in the differentiation of Th1 cells, the inhibition of Th2 cells and Th17 cells in Th1 cell development; highly polarized, mainly the role of IL-27 is to limit the immune response to Th1 intensity and duration, thereby protecting the body from excessive immune response and damage, which has the characteristics of both pro-inflammatory and anti-inflammatory. Inflammatory chemokine 5 (RANTES/C CL5) is an inflammatory T lymphocyte chemotactic factor, can induce leukocyte adhesion and blood-brain barrier (Blood-brainbarrier, BBB) into the CNS, causing inflammation and secondary lesions. A series of studies found that in relapsing remitting MS, inhibiting the expression of CCL5 can prevent the recurrence of the disease. At present, there are many domestic and foreign research and reports suggest that in autoimmune inflammatory diseases, IL-27 and CCL5 in the body there is a certain correlation, but there is no related report and study its mechanism. Through this experiment in experimental autoimmune encephalomyelitis (experimental autoimmune cerebrospinal meningitis, EAE) model in vitro culture of peritoneal macrophages and explore the regulation of IL-27 CCL5 is affected by changes in EAE lesions in the process, and to explore its mechanism, to provide clinical guidance for the prevention of MS disease progression and recurrence.
Method锛

本文编号：1680429