体外三维微环境增强胶质瘤细胞“干性”和诱导化疗耐药作用及其机制

发布时间：2018-03-29 22:26

本文选题：胶质瘤　切入点：三维培养　出处：《第三军医大学》2016年博士论文

【摘要】：胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,约占全部中枢神经系统肿瘤的40~50%。它治疗效果较差,纵然近年来对恶性胶质瘤的发病机制和治疗研究取得了一定进展,制订了根治性切除术,术后予以放疗同步并序贯替莫唑胺化疗的标准治疗方案,但多个大样本的临床研究显示高级别恶性胶质瘤的平均中位生存期仍然没有突破18个月。最大的治疗难点在于治疗后复发以及对化疗药物耐药所导致的治疗失败。近年来的研究发现这种复发可能与胶质瘤里存在的一群特殊的细胞群体即胶质瘤干细胞有关,它们是具有自我更新和更强成瘤能力的种子细胞,在胶质瘤的进展和复发中起着决定性作用。同时,这群细胞也具有着比普通细胞更强的治疗抵抗作用,与多种其他的因素一起导致胶质瘤的耐药发生,最终导致治疗失败。因而对这些胶质瘤干细胞以及胶质瘤耐药的相关研究将成为改善胶质瘤治疗疗效的重点和热点。但是目前进行这方面基础研究的体外细胞培养技术却有着各自的弊端,最大的问题就是失去了肿瘤体内生长的维度空间和细胞外基质,难以提供一个良好的肿瘤微环境,而肿瘤微环境对肿瘤细胞的干性维持、细胞间通讯、侵袭转移以及药物抵抗等多种恶性生物学行为都会产生显著的影响。这种微环境的丧失最终导致了很多体外试验与最后的体内试验结果不符,浪费了研究经费与时间,甚至一些错误的前期结论会将研究方向完全带往错误的方向。因此,这些特定方向的肿瘤基础研究急需寻找一种更好的体外培养方法。近十几年来,随着细胞培养技术、组织工程学和生物材料科学的发展,细胞培养正在步入一个由“二维单层”迈向“三维立体”的新阶段。多种具有良好生物相容性和力学性能,可以更好模拟体内细胞生长基质,给予细胞生长以足够机械支撑的三维仿生支架材料已经开始应用于肿瘤细胞生物学的研究。但是目前在胶质瘤的相关研究中,还有很多不足,例如没有选择更接近于体内微环境的支架材料,缺乏肿瘤物理微环境和胶质瘤干细胞以及耐药相关的深度研究等。这些问题没有得到很好的解决,也制约了胶质瘤干细胞、胶质瘤耐药机制和抗胶质瘤药物筛选研发的进一步研究。本研究针对这些现状,制备了一种新型的三维多孔胶原支架,系统的研究如何应用这种支架来进行胶质瘤细胞的培养,怎么能更好的将这种支架培养方法应用于各种检测,应用这种三维胶原支架培养对胶质瘤细胞的各种表型、干性水平还有耐药情况与传统培养方法相比有什么样的改变。具体研究内容主要包括以下三个部分。第一部分多孔三维胶原复合支架培养胶质瘤的模型建立及其一般表型观察目的:为了更好的研究胶质瘤细胞的恶性生物学行为,本研究拟建立一种更加模拟体内肿瘤微环境的胶质瘤体外三维培养模型。考虑到胶质瘤细胞外基质的最主要成分是胶原蛋白。选取胶原制作成多孔三维支架,将其应用于胶质瘤细胞体外培养,观测细胞在支架上的粘附、生长、增殖、凋亡等多种表型,评价该支架能否较好的支持胶质瘤细胞生长,进而初步探讨胶质瘤细胞在新型三维培养模型的微环境下细胞表型较传统培养方法发生的变化。方法:采用电子显微镜观察制备的支架材料,测算平均孔径。通过粘附接种来摸索支架细胞培养方法,通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观测胶质瘤细胞在支架上的粘附、迁移和增殖情况,通过HE染色来观测不同生长体系中胶质瘤组织形态,通过扫描电镜成像观察胶质瘤细胞的超微结构,通过CCK8法检测不同培养方法的细胞生长速率并用流式细胞术检测其细胞周期、增殖、凋亡和分化情况。结果:三维胶原支架提供了合适的孔径和细胞外基质,胶质瘤细胞可以在支架上良好的粘附,并且该支架利于胶质瘤细胞迁移到支架内部,利于胶质瘤组织的体外再生形成。在三维胶原支架上生长的胶质瘤细胞呈现了更拟真的自然形态和生长浸润方式,更慢的细胞倍增时间和更多的G0/G1期细胞。它们与传统的二维培养相比,增殖明显降低而凋亡变化不明显,同时发生了去分化的现象。结论:三维胶原支架是一种小孔径的多孔立体网络支架,胶质瘤细胞可以在其表面和内部良好的生长,并且表现出很多不同于传统单层培养的表型,部分特征与体内胶质瘤细胞相似,在组织工程胶质瘤体外研究中有很好的应用前景。第二部分三维胶原支架培养体系对恶性胶质瘤细胞干性水平的影响与验证目的:之前的试验中明确了三维胶原支架培养胶质瘤细胞的可行性和良好仿生性。而且发现了三维胶原支架上生长的胶质瘤细胞表现出一些胶质瘤干细胞才具有的生物学特征,如发生了去分化,并且静息状态细胞比例增加等。而目前GSCs的富集培养手段还很有限,传统二维细胞培养方法不能很好的达到富集的效果。因此本部分内容着力用多种实验手段来探讨三维胶原支架培养方法对胶质瘤细胞干性水平的影响和验证,明确其作为GSCs富集培养新方法的可行性。方法:采用免疫荧光方法和流式细胞术检测不同培养条件下的CD133阳性胶质瘤细胞比例,再通过RT-PCR方法和Western blotting方法检测二维和三维培养胶质瘤细胞的主要干性转录因子Nanog、Oct-4和Sox2的表达水平,最后通过平板克隆、细胞成球和皮下移植瘤实验检测不同培养模型中胶质瘤细胞的干性水平。结果:三维胶原支架培养的胶质瘤细胞与传统二维贴壁培养相比,CD133阳性细胞比例明显升高,高表达干性转录相关因子Sox2和Nanog,并且具有更强的成球能力、平板克隆形成能力和移植瘤成瘤能力。表明三维胶原支架培养具有诱导胶质瘤细胞干性水平上调的作用。结论:本部分试验结果提示三维胶原支架培养的胶质瘤中含有更多的GSCs,这种组织工程培养方式可以有效诱导胶质瘤细胞干性水平上调。第三部分三维胶原支架培养诱导胶质瘤细胞耐药形成及其机制的初步探讨目的:在建立了三维胶原支架胶质瘤细胞培养模型的基础上,进一步观察现阶段临床主要抗胶质瘤药物对不同培养模式胶质瘤细胞的抑制情况,明确我们的三维培养体系是否可以诱导耐药,并初步研究其相关机制,探讨三维胶原支架培养是否可以作为更好的抗胶质瘤治疗药物检测平台。方法:使用胶质瘤U87细胞株和原代细胞,通过CCK8试剂盒测算不同化疗药物对胶质瘤细胞的IC50值以及人血浆峰值浓度下对细胞的抑制率,通过RT-PCR检测主要耐药相关因子基因水平的表达,最后通过免疫蛋白印迹验证出现改变的耐药因子在蛋白水平的表达。结果:三维胶原支架培养的胶质瘤细胞与传统二维贴壁培养相比,对临床一线和二线的常用化疗药物具有更强的抵抗作用,这种耐药现象在对烷化剂的抵抗中更为突出。进一步研究结果显示这种物理微环境改变诱导的耐药可能是通过肿瘤细胞干性水平的上调和DNA修复蛋白MGMT表达增加实现的,其中通过改变生长维度和细胞外基质导致MGMT出现过表达是首次见诸报道。而且人血浆峰值浓度下,化疗药物对三维胶原支架中生长的胶质瘤细胞的平均抑制率更接近于胶质瘤患者对这些药物的客观反应率。结论:三维胶原支架培养可以有效的诱导胶质瘤细胞出现耐药,这种耐药的产生与肿瘤细胞干性上调和重要耐药因子MGMT表达增加相关。应用三维胶原支架培养模型可以更好的服务于抗胶质瘤药物的研发和肿瘤物理微环境诱发耐药机制的深入探索。综上所述,本研究在成功建立三维胶原支架胶质瘤细胞培养模型的基础上,发现了三维胶原支架培养可以上调胶质瘤细胞干性,并诱导胶质瘤细胞耐药的特性,通过多种手段分析了该生物学行为的分子基础,验证了其作为抗胶质瘤药物测试和筛查平台的可靠性。这种三维胶原支架培养胶质瘤细胞的方法有望为胶质瘤干细胞靶向药物的研发和肿瘤微环境相关耐药机制的深入研究提供更好的试验平台。
[Abstract]:In recent years , it has been found that this kind of tumor may be associated with a group of special cell populations , such as glioma stem cells , which are self - renewing and tumor - resistant . Conclusion : Three - dimensional collagen scaffold is a kind of porous three - dimensional network scaffold with small pore size . Conclusion : Three - dimensional collagen scaffold culture can effectively induce the expression of multidrug resistance in glioma cells .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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