PTEN介导NR2B-Tyr信号通路参与大鼠偏头痛慢性化的维持机制

发布时间：2018-03-31 13:46

本文选题：慢性偏头痛　切入点：PTEN　出处：《重庆医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的偏头痛是神经内科中最多见的可致残疾病中的一种，可以严重影响患者的生活质量，发作期处于感觉超敏状态，以自发痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperakesia)及触诱发痛(allodynia)为特点。而慢性偏头痛一般由发作性偏头痛经过数月到数年发展而成，其病理性进展可以通过中枢致敏(central sensitization)来解释，电生理学和影像学的研究表明，慢性偏头痛的发生与脑干进行性的异常变化有关。目前很多研究表明，慢性偏头痛中枢高敏感性由NMDAR-NOS-NO介导。 N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是兴奋性递质谷氨酸受体的一种类型，属于离子型受体，，其广泛分布于中枢神经系统，在中枢神经系统中对神经元信号的传递和基因表达的调控起着重要作用，还是突触可塑性及皮质和海马神经元长时程增强效应的主要调控者。NMDAR是由NR1、NR2A-D及NR3A-B共7种亚单位组成的异四聚体，其中NR1是功能亚单位，NR2和NR3是调节亚单。NR2亚单位包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D四种，其中NR2B受体亚型在疼痛的产生及中枢性痛觉敏化形成和慢性偏头痛形成等方面均有重要作用。由于NMDAR通道活性由蛋白激酶和磷酸化介导，所以慢性偏头痛的维持很可能是由脑干三叉神经尾核中NR2B的磷酸化来介导。 NO是在偏头痛发作时起关键性作用的一种媒介分子，可以使三叉神经系统各个水平的神经元活化，包括脑干中的三叉神经脊束核。NO体内供体包括钙／钙调蛋白依赖的结构型NOS(eNOS，nNOS)以及不依赖Ca的诱导型NOS(inducible NOS．iNOS）。在硬脑膜上滴入外源性NO供体硝酸甘油，可以引起大鼠三叉神经脊束核的神经元发生迟发型放电，而在体内中枢神经系统中，NO的合成主要与谷氨酸的释放有关，释放的谷氨酸激活NR促使Ca2+内流，胞浆内Ca2+浓度达到400nM时，就会激活nNOS，促进神经元NO的生成，最终引起偏头痛。第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase andtensin homology deleted on chromoso-me ten，PTEN)是一个近年来新发现的同时具有脂质和蛋白质双重磷酸酶活性的抑癌基因，其广泛分布于中枢神经系统，不仅对神经系统的发育及正常功能的维持具有重要作用，同时与脑缺血、癫痫、药物成瘾性等神经精神障碍疾病的发生密切相关。有研究发现,下调PI'EN可对谷氨酸通过NMDAR诱导的神经元损伤具有保护作用,但PTEN基因是否可通过调节NR2B磷酸化影响慢性偏头痛的病理过程，目前尚未见相关报道。本研究在已知NR2B-Tyr／NOS／NO通路很有可能是慢性偏头痛发病的病理机制之一与慢性偏头痛的中枢致敏主要发生在三叉神经脊束核的基础上，利用RNAi重组腺病毒(AdR—siPTEN)下调偏头痛大鼠模型三叉神经脊束核的PTEN基因，观察其对慢性偏头痛大鼠行为学的影响，同时探讨PTEN是否可通过调节NR2B-Tyr影响NO的合成，继而抑制慢性偏头痛的维持。材料与方法1动物分组及处理：以清洁级成年雄性Sprague—Dswley(SD)鼠为实验对象，随机分为4组。模型组：第一个月由硬脑膜注射炎性汤，每两天一次，共14次，第二个月依Tassorelli法皮下注射硝酸甘油10mg/kg，每周一次，共4次，制作实验性慢性偏头痛大鼠模型。对照组：与模型组同步对照，以生理盐水代替炎性汤硬脑膜注射及硝酸甘油皮下注射。模型干预组：自模型组造模成功后，在三叉神经脊束核处注射AdR-siPTEN以转染模型组大鼠三叉神经脊束核。对照干预组：与模型干预组同步，在三叉神经脊束核处注射AdR-siPTEN以转染对照组大鼠三叉神经脊束核。 2行为学与痛阈观察：第9周时观察模型组、对照组、模型干预组、对照干预组60min-90min内挠头、咬尾、爬笼、往返运动的次数总和(每个症状出现1次计1分)。将Ectronic vorl Frey rigid tip探针安放于探针尖上，再刺激大鼠双侧眼眶周围，逐渐施加压力直到大鼠自动逃离，观察此时的压力值即为大鼠的机械性痛阈值。 3受试动物于转染AdR-siPTEN后一周（第9周）分别断头处死，取大鼠三叉神经脊束核组织，液氮内保存。 4取大鼠三叉神经脊束核，作厚15μm连续冰冻切片，在荧光显微镜下观察三叉神经脊束核中荧光蛋白的表达。 5RT-PCR法半定量检测大鼠三叉神经脊束核组织PTEN mRNA的表达。 6Western印迹法：对标本进行提取蛋白、蛋白定量后，煮沸，电泳分离蛋白，然后转膜，进行蛋白印迹，显色后照相并进行灰度值分析。检测大鼠三叉神经脊束核组织PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表达。 7NOS测定试剂盒、NO测定试剂盒测定各观察组三叉神经脊束核组织内NOS、NO含量。结果1大鼠行为学与痛阈结果：模型干预组较对照组与对照干预组行为学改变无明显差异(P0.05)，模型组较对照组与对照干预组行为学改变有明显差异(P0.05)，模型干预组较模型组行为学改变也有明显差异(P0.05)。痛阈结果与行为学类似。 2大鼠转染腺病毒1周后，大鼠三叉神经脊束核组织出现红色荧光蛋白阳性表达，表明PTEN基因腺病毒转染成功。 3RT-PCR结果显示PTEN mRNA的表达情况：与对照组相比，模型组PTEN mRNA表达无明显差异(P0.05)。与对照干预组相比，模型干预组PTEN mRNA表达无明显差异(P0.05)。对照干预组的PTENmRNA表达量为对照组的52.47%，具有显著差异(P0.05)。模型干预组的PTEN mRNA表达量为模型组的53.22%，具有显著差异(P0.05)。 4Western印迹法显示PTEN、NR2B-Tyr蛋白的表达情况：PTEN蛋白在各组的表达与PTEN mRNA在各组的表达情况相似。与模型组相比，模型干预组NR2B-Tyr蛋白表达有明显差异(P0.05)。与对照组相比，模型干预组NR2B-Tyr蛋白表达无明显差异(P0.05)。对照组与对照干预组相比，NR2B-Tyr蛋白表达同样有明显差异(P0.05)。 5NOS、NO含量：与模型组相比，模型干预组NOS、NO表达有明显差异(P0.05)。与对照组相比，模型干预组NOS、NO表达无明显差异(P0.05)。对照组与对照干预组相比，NOS、NO表达也有明显差异(P0.05)。结论1慢性偏头痛大鼠模型三叉神经脊束核NOS、NO含量及NR2B-Tyr蛋白表达明显增加。 2转染AdR-siPTEN后，慢性偏头痛大鼠模型三叉神经脊束核PTEN mRNA及PTEN蛋白明显降低，NR2B-Tyr蛋白表达明显降低，NOS、NO含量明显降低，表明下调PTEN基因对慢性偏头痛大鼠具有一定保护作用。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R747.2

【参考文献】