米诺环素调控小胶质细胞表型对大鼠缺血性脑卒中的保护效应及机制研究

发布时间：2018-04-14 17:07

本文选题：M1型小胶质细胞 + M2型小胶质细胞　；参考：《第三军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：缺血性脑卒中(Ischemic Stroke)是最常见的神经系统疾病之一,占脑血管疾病的70%,致死、残率高,严重威胁着人类的健康,给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担。近年来针对缺血性脑卒中的研究已成为神经科学研究的热点,但其病理机制及干预靶点仍不清楚,临床上缺乏有效治疗手段。米诺环素(Minocycline)是半合成第二代四环素类衍生物,具有抗炎、杀菌功效,作为抗生素已广泛使用于临床。米诺环素易透过血脑屏障的特性备受神经科学研究者青睐。近年大量研究证实米诺环素在脑出血、脑外伤等多种神经系统疾病中具有神经保护效应。Tang等发现米诺环素可通过内源性大麻素受体激活,调控小胶质细胞从M1型(细胞毒)向M2型(神经保护)转换,改善新生儿脑出血后神经功能障碍。项目组前期研究发现米诺环素能显著抑制新生儿脑出血后小胶质细胞增殖、炎症因子释放的脑继发损伤因素;Yrjanheikki等通过动物实验及离体细胞培养首次证实米诺环素可减少MCAO诱导的大鼠神经元凋亡,但米诺环素的治疗靶点及相关分子机制仍不清楚。研究证实激活后的M1型小胶质细胞是神经炎症的主要参与者,分泌肿瘤坏死因子(TNF-α),白介素-6(IL-6)等多种神经炎症因子,促进周围神经细胞凋亡,加重脑损伤;M2型小胶质细胞可分泌脑源性神经营养因子(BDNF),胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors-1,IGF)等神经保护因子,促进神经元修复从而发挥神经保护作用。核转录因子Kappa B(Nuclea Factor-Kappa B,NF-κB)是多种炎症介质的关键调节蛋白,其中发挥主要生理功能的是两个亚基蛋白P50与P65,两者构成二聚体。NF-κB抑制蛋白(Inhibitor Of NF-κB,IκB)的磷酸化降解是NF-κB激活的主要途径。近期研究证实NF-κB可调控NLRP炎症小体激活,而且在缺血性脑卒中(Ischemic stroke)后继发脑损伤的过程中参与并发挥作用,是细胞凋亡的主要调控途径之一。本研究拟通过MCAO模型观察大鼠缺血后早期脑梗塞面积、神经元凋亡、小胶质细胞形态变化以及学习记忆功能改变,从以下两个部分探讨米诺环素在大鼠缺血性脑卒中早期脑损伤的神经保护作用及可能的作用机制。一、缺血性脑卒中后小胶质细胞表型变化及特征目的动态观察MCAO后M1型小胶质细胞和M2型小胶质细胞的形态和数量变化,探讨小胶质细胞形态转换在缺血性脑卒中后的作用及意义。方法通过线栓法制备大鼠缺血性脑损伤(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,将实验动物随机分成对照组和MCAO 6小时、24小时组以及72小时组,通过Western blot实验检测小胶质细胞特异性抗体(Iba-1)表达情况,使用Q-pcr技术检测M1型小胶质细胞特异性蛋白CD16、CD11以及M2型小胶质细胞特异性蛋白CD86、CD206表达情况。结果在不同时间段断头取脑,使用大鼠缺血半球脑组织实施WB免疫印迹实验,发现MCAO后6小时小胶质细胞特异性蛋白(Iba-1)含量显著增加,并在24小时后程上升趋势,在MCAO72小时后Iba-1蛋白含量逐渐降低,可能与M2型小胶质细胞逐渐增多相适应。CD86与CD206相似是M2小胶质细胞相关蛋白之一,CD11b与CD16是M1型小胶质细胞相关蛋白,其编码基因的改变也可间接说明大鼠脑缺血后保护性M2型小胶质细胞的变化情况。结果发现在缺血早期M1型小胶质细胞相关蛋白增加,在72小时时相对减少,而M2型小胶质细胞相关蛋白表达情况正相反,证实大鼠MCAO后小胶质细胞形态可能发生转换,假设该现象与自身修复应激反应相关,M2型小胶质细胞增加是机体修复的信号。结论该研究通过动物在体实验证实大鼠缺血性脑卒中后小胶质细胞形态在72小时内发生转换的可能,提出小胶质细胞从损伤早期M1形态向后期M2型转换可能是机体自身修复机制启动的原因。因此,在MCAO后外源性干预小胶质细胞形态转换可能是缺血性脑卒中临床治疗的新策略。二、米诺环素调控小胶质细胞表型对大鼠缺血性脑卒中的保护效应及机制研究目的通过实验观察大鼠早期缺血性脑损伤的病理生理特点,探讨米诺环素在缺血性脑损伤早期的神经保护效应及可能机制。方法线栓法制备大鼠缺血性脑损伤(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在MCAO 6、24 h分别给予米诺环素腹腔注射,通过TTC染色观察脑梗死面积、TUNEL染色及尼氏染色检测神经元凋亡情况;免疫荧光染色了解小胶质细胞形态变化以及Western blot检测凋亡通路NF-κB表达情况。使用Morris水迷宫检测手术28 d后大鼠学习记忆能力。结果米诺环素减少MCAO 6 h后大鼠脑梗塞面积[(43.0±5.3)cm3vs(36.0±6.8)cm3,P0.01],减少脑神经元凋亡数量并促进M2型(神经保护型)小胶质细胞增殖,MCAO24 h后米诺环素治疗不能改善脑梗塞以及神经元细胞凋亡(P0.05)。米诺环素显著减少MCAO 6 h诱导的凋亡信号通路蛋白NF-κB的表达(P0.01)。MCAO 28 d后大鼠学习记忆能力较假手术组显著降低;米诺环素显著改善MCAO后学习记忆能力(P0.05),而MCAO 24 h后米诺环素不能改善大鼠神经功能障碍,差异无统计学意义(P0.05)。结论米诺环素能促进缺血性脑卒中早期活化小胶质细胞向M2型转化并抑制凋亡信号通路,减轻脑缺血诱导的神经炎症及细胞凋亡,改善大鼠学习记忆功能。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.3

【参考文献】