大麻素2型受体激动对凝血酶所致大鼠脑水肿的干预效应及机制研究

发布时间：2018-04-21 22:35

  本文选题：凝血酶 + 脑水肿　； 参考：《第三军医大学》2016年硕士论文

【摘要】：脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种严重的致死、致残性疾病。在北美、欧洲以及澳大利亚,脑出血占所有卒中类型的10 15%;而在亚洲,该比例则高达20 30%;全世界每年报道的新发脑出血病例更是高达200,000例。脑出血病人第一个月的死亡率高达30-50%,目前脑出血仍缺乏有效的治疗措施,且存活下来的病人也留下不同程度的神经功能障碍。脑水肿(Brain edema)是脑出血之后一种重要的继发性损伤。脑水肿导致脑出血后占位效应和颅内压增加,并直接损伤脑组织和导致最终脑疝的发生;脑水肿也可以直接通过渗透压改变引起神经元和神经胶质细胞毒性,也能直接破坏血脑屏障(blood brain barrier,BBB)。多种因素包括凝血因子的细胞毒性、炎症反应等导致脑水肿的发生,其中,凝血酶是介导脑出血后早期脑水肿形成的重要机制,凝血酶抑制剂阿加曲班或水蛭素能减轻实验性大鼠脑出血后脑水肿。向大鼠侧尾壳核区注入凝血酶能在几小时内诱导脑水肿的快速形成,且水肿在1-3天内达到高峰,在随后几周内逐渐缓解,并且脑水肿的严重程度和血脑屏障的通透性是一致的。凝血酶能激活大脑细胞内多种分子信号通路,而细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是其中最常见的一种。根据Xi等文献报道,向大鼠基底节区注入凝血酶后,该信号通路被激活,表明该通路与脑水肿的发生存在密切相关。内源性大麻素受体系统(endocannabinoid system,e CBs),包括内源性大麻素受体、内源性大麻素配体以及内源性降解酶,该系统在多种神经系统疾病中常作为重要的药物治疗靶点。目前发现的大麻素受体包括两种,即大麻素1型受体(Cannabinoid receptor type 1,CB1R)和大麻素2型受体(Cannabinoid receptor type 2,CB2R)。具有致精神兴奋作用的大麻素1型受体主要表达在神经元上,同时由于该受体的精神作用,限制其药物开发潜力,因此,发掘CB2R激动剂的治疗作用更具实际临床意义。CB2R主要表达在免疫细胞上,主要有抗炎、免疫细胞迁移、细胞因子产生以及抗原提成作用。CB2R的抗炎神经保护作用已经在多种动物模型包括多发性硬化(multiple sclerosis,MS)、阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease,AD)中得到研究证实。课题组前期研究已证实,选择性CB2R激动剂JWH133能减轻幼鼠生发基质出血(germinal matrix hemorrhage)模型的脑水肿,但具体机制尚不清楚。因此推测,选择性CB2R激动剂JWH133对凝血酶所致的脑水肿同样有干预作用。本课题在凝血酶注入大鼠右侧基底节后,采用CB2R激动剂JWH133进行干预,观察JWH133对大鼠脑水肿的干预效应并进一步探索其涉及的具体机制。分两部分研究验证上述推测:第一部分在凝血酶注入后,检测大鼠脑组织含水量变化情况以及血脑屏障的损伤情况,第二部分在凝血酶注入后,给予选择性CB2R激动剂JWH133干预,观察JWH133对凝血酶所致脑水肿的干预效应并探讨其可能涉及的具体机制。一、凝血酶致大鼠脑水肿及血脑屏障损伤的作用研究目的在凝血酶注入大鼠右侧基底节后24h,检测大鼠脑组织含水量变化情况以及血脑屏障的损伤情况。方法实验动物随机分为生理盐水组(Saline)和凝血酶组(Thrombin),生理盐水组将5u生理盐水注入大鼠右侧基底节,凝血酶组将5u(20U)凝血酶(Sigma)溶液注入大鼠右侧基底节。术后24h用干湿重法测量脑组织含水量及伊文斯蓝渗出实验评估血脑屏障完整性,采用免疫荧光检测小胶质细胞活化情况及Western blot法检测金属基质蛋白酶9表达情况。结果1.凝血酶溶液注入大鼠右侧基底节区后24h,脑组织含水量与生理盐水组相比显著上升(p0.01),2.凝血酶溶液注入大鼠右侧基底节区后24h,凝血酶损伤区域附近的伊文斯蓝渗出量较生理盐水组显著增加(p0.05),表明血脑屏障损伤明显,3.免疫荧光结果显示凝血酶注入后基底节区Iba-1阳性的的小胶质细胞数目较生理盐水组明显增加(p0.05),Western blot结果显示凝血酶注入后金属基质蛋白酶9表达情况均较生理盐水组明显增加(p0.05)。因此推测:小胶质细胞的活化、金属基质蛋白酶9表达上调可能参与了凝血酶导致的脑水肿及血脑屏障损伤过程。结论本部分研究观察了凝血酶注入后24h脑含水量、伊文斯蓝渗出量变化情况以及小胶质细胞活化、金属基质蛋白酶9表达情况。实验结果显示大鼠凝血酶注入后存在明显的脑水肿以及血脑屏障损伤,且小胶质细胞活化、金属基质蛋白酶9表达上调可能与脑水肿形成及血脑屏障的损伤过程相关。二、大麻素2型受体激动剂JWH133对大鼠凝血酶所致脑水肿的干预效应及机制研究目的观察CB2R活化对凝血酶所致大鼠脑水肿的干预效应,并进一步探讨其涉及的具体机制。方法本部分实验分为假手术组(Sham)、凝血酶+溶剂干预组(Vehicle)、凝血酶+JWH133干预组(JWH)、凝血酶+SR144528+JWH133干预组(SR+JWH)。首先,Sham组仅进针;然后选择适宜的JWH133给药时间,JWH组在凝血酶注入基底节后1h给予JWH133腹腔注射(1.5 mg/kg)治疗;Vehicle组同时给予相应剂量的溶剂腹腔注射;JWH133特异性阻断剂SR144528(3mg/kg)于JWH133注射前3min提前腹腔注射。所有动物于建模型后24h取标本,采用干湿重法测脑水含量和荧光显微镜/分光光度计观察检测伊文斯蓝渗出情况,免疫荧光法检测小胶质细胞活化、ERK信号通路和紧密连接蛋白ZO-1表达情况。western blot法检测ERK信号通路、金属基质蛋白酶9/12和紧密连接蛋白ZO-1表达情况。结果1.与Vehicle组相比较,JWH133干预后显著减轻大鼠凝血酶所致的脑含水量和伊文斯蓝渗出量(p0.05),2.免疫荧光显示凝血酶注入后磷酸化的ERK信号通路与Iba-1阳性的小胶质细胞共标,且与Vehicle组相比较,JWH13干预后JWH组磷酸化的ERK信号通路表达量较Vehicle组降低(p0.05),3.与Vehicle组相比较,金属基质蛋白酶9/12在JWH133干预后表达较Vehicle组下调(p0.05),同时紧密连接蛋白ZO-1在JWH133干预后表达较Vehicle组增加(p0.05)。以上干预作用,在同时给予JWH133特异性抑制剂SR144528之后被逆转。结论在大鼠凝血酶所致脑水肿后,给予CB2R激动剂JWH133干预能减轻凝血酶所致脑水肿,其机制可能与抑制ERK信号通路磷酸化,进一步降低细胞金属基质蛋白酶9/12分解和增加紧密蛋白表达相关,从而发挥保护血脑屏障、减轻脑水肿的作用。CB2R激动有望成为脑出血后脑水肿治疗的潜在靶点。
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本文编号：1784397