白藜芦醇对斑马鱼多巴胺神经元的保护作用及其机制研究

发布时间：2018-04-23 19:37

本文选题：斑马鱼 + 多巴胺神经元　；参考：《成都医学院》2017年硕士论文

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,发病与黑质多巴胺神经元选择性、进行性死亡有关,确切机制不清。文献报道,氧化应激在帕金森病的发生发展过程中起重要作用。白藜芦醇(trans-3,4',5-trihydroxystilbene,RE)是一种存在于多种植物中的天然物质,具有抗氧化损伤与抑制炎症反应的作用,对帕金森病是否具有预防治疗作用尚未明确。因此,本研究旨在观察白藜芦醇对MPTP致PD斑马鱼的神经元保护作用,并探讨其作用的可能机制。目的研究白藜芦醇对PD斑马鱼多巴胺神经元是否具有保护作用,并初步探讨其作用的机制。白藜芦醇是一种天然多芬物质存在于葡萄、花生、桑葚和虎杖中,因其具有保护心血管、抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗局部缺血的生物特性,已受到医学研究的青睐[1]。帕金森病是由中脑黑质部位多巴胺神经元变性坏死,造成纹状体内多巴胺含减少量而造成的[2]。我们前期的实验发现,MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)可导致斑马鱼多巴胺神经元减少,PD斑马鱼尾巴弯曲、游泳行为改变,PD相关基因表达下降等类似帕金森病的表现[3]。白藜芦醇对MPTP诱导的帕金森病斑马鱼多巴胺神经元是否具有保护作用引起了我们的兴趣。本研究以MPTP处理的斑马鱼作为帕金森病动物模型,研究白藜芦醇对帕金森病斑马鱼多巴胺神经元的影响及其作用机制。方法斑马鱼饲养采用大型自动循环养殖系统,自动光照-黑暗比为14h/10h,实验采用野生型AB品系斑马鱼及Tg(vmat2:GFP)转基因斑马鱼,每日投食三次,于晚间投食后选取亲鱼交配,次日收集胚胎放于28.5℃培养箱内培养,待斑马鱼培养至72小时后将斑马鱼转移至六孔板内待用。实验分为五组:1)空白对照组(con组);2)200 u M/m L MPTP处理组(MPTP组);3)60 u M/m L白藜芦醇处理组(RE组);4)先加60 u Mm/L RE,12 h后加200 um MPTP/m L组(MR1组);5)先加200 u M/m L MPTP,12 h后加60u M/m L RE组(M1R组)。各组在发育至第四天时进行实验。激光共聚焦显微镜观察Tg(vmat2:GFP)转基因斑马鱼多巴胺神经元和野生型AB品系斑马鱼TH免疫荧光。实时荧光定量PCR方法分别检测PD相关基因parkin、pink1、dj-1和凋亡相关基因bax、p21、bcl2及抗氧化基因sod、cat、ho-1表达水平。TUNEL染色法观察斑马鱼脑部细胞凋亡。免疫印迹法检测NRF2的表达水平。结果1.MPTP处理后野生型斑马鱼出现尾巴弯曲,游泳行为减少,游泳速度减慢,转弯增多,在六孔板中斑马鱼游至孔周边的现象,并且出现心率减慢,每分钟约40次(空白对照组约每分钟80次),M1R和MR1组尾部弯曲得到了缓解,游泳行为、速度等得到一定程度恢复,心率减慢得到缓解。2.Tg(vmat2:GFP)转基因斑马鱼,MPTP处理后,多巴胺神经元数量减少,荧光亮度减低,并有部分区域缺失。M1R和MR1组斑马鱼多巴胺神经元减少程度较MPTP组轻,荧光亮度亦有增强,初步说明白藜芦醇可保护斑马鱼多巴胺神经元。3.在野生型斑马鱼中,TH免疫荧光结果显示,MPTP可导致TH阳性神经元数量减少,荧光强度减弱,M1R和MR1组TH阳性神经元数量减少较MPTP组有所缓解,荧光强度亦见回升。药物加入的先后顺序对该实验结果无影响。4.实时荧光定量PCR结果显示,MPTP处理组,PD相关基因表达水平下调,尤其是parkin和dj-1下降明显,M1R和MR1组表达量回升,说明白藜芦醇可保护PD相关基因,保护线粒体;抗氧化基因cat、sod和ho-1在MPTP组表达下降,加入白藜芦醇后(M1R组和MR1组)表达回升,说明白藜芦醇保护多巴胺神经元可能是通过影响体内氧化应激来实现的;MPTP组凋亡相关基因bax、p21表达上升,bcl2表达下降,M1R和MR1组其表达量部分恢复。5.TUNEL染色结果显示MPTP处理斑马鱼后,斑马鱼头部细胞凋亡明显增加,多巴胺神经元数量减少,继加入白藜芦醇后凋亡数量较MPTP组减少,M1R组和MR1组没有明显的差异,白藜芦醇单独处理组和对照组细胞凋亡无明显差异,说明白藜芦醇对斑马鱼无毒性作用,并可保护多巴胺神经元。6.免疫印迹结果显示,MPTP处理组NRF2蛋白表达明显下降,加入白藜芦醇后,表达量回升,差异具有统计学意义。白藜芦醇单独处理也可激活NRF2的表达。M1R和MR1组表达量差异不明显。表明白藜芦醇的保护作用可通过影响NRF2/ARE信号途径来实现。结论1.MPTP诱导的PD斑马鱼模型构建成功,白藜芦醇减轻MPTP毒性的同时其自身不会对斑马鱼造成损伤。2.MPTP处理后转基因斑马鱼间脑腹侧多巴胺能神经元减少,加入白藜芦醇后上述现象得到一定程度缓解,初步说明白藜芦醇可保护斑马鱼多巴胺神经元;TH抗体整胚免疫组化显示,白藜芦醇可减轻TH阳性神经元的丢失,进一步说明白藜芦醇可保护斑马鱼多巴胺神经元。3.白藜芦醇可调节PD相关基因、凋亡相关基因和抗氧化相关基因的表达,从而保护多巴胺神经元,表明白藜芦醇的保护作用可通过抑制氧化应激的产生来实现。4.白藜芦醇可减轻因MPTP造成的细胞凋亡。5.白藜芦醇保护多巴胺神经元可通过影响NRF2/ARE信号通路来实现的。
[Abstract]:Parkinson ' s disease ( PD ) is a common degenerative disease of the central nervous system . The pathogenesis of Parkinson ' s disease is related to the selective and progressive death of dopaminergic neurons . It has been reported that it plays an important role in the development of Parkinson ' s disease . Parkinson ' s disease is caused by degeneration and necrosis of dopamine neurons in the nigra of mesencephalon , resulting in degeneration of dopamine in the striatum . In our previous experiments , MPTP ( 1 - methyl - 4 - phenyl - 1,2,3,6 - tetrahydropyridine , MPTP ) could lead to the reduction of dopaminergic neurons in zebrafish , the changes of the tail of PD zebra fish , the change of swimming behavior , and the decrease of PD - related gene expression . The effects of resveratrol on the dopaminergic neurons of Parkinson ' s disease ( MPTP ) induced by MPTP were studied . The effects of resveratrol on the dopaminergic neurons in Parkinson ' s disease were studied . The results showed that there was no significant difference in the number of neurons in MPTP treated group and M1R group and MR1 group . The results showed that resveratrol could protect the dopaminergic neurons of zebrafish .

【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5

【相似文献】