匹罗卡品致痫大鼠模型痫性发作潜伏期后齿状回γ-氨基丁酸能中间神经元活动状态的研究

发布时间：2018-04-30 05:12

  本文选题：癫痫持续状态 + γ-氨基丁酸能中间神经元　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：[背景]颞叶癫痫是成人患者中最为常见的癫痫类型,占局灶性癫痫的65%左右,近1/3的颞叶癫痫患者不能以现有治疗方法进行有效的控制。除典型的反复出现的自发痫性发作外,颞叶癫痫患者通常还伴有认知障碍、情绪状态以及社会适应行为异常等表现。颞叶癫痫通常伴有显著的海马结构组织病理学改变,表现为以CA1锥体细胞层细胞为代表的神经元丢失、神经胶质细胞增生、以苔藓纤维出芽(mossy fiber sprouting)为特征的突触重建、颗粒细胞离散化(dispersion)及齿状回的神经新生增强等。因此,海马结构尤其是齿状回被认为在颞叶癫痫的形成中起关键作用。有关颞叶癫痫患者痫性发作形成的机制尚未完全阐明。在用于解释癫痫形成的主要假说中,γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)能神经抑制减弱这一假说最为著名。这一假说认为GABA能中间神经元介导的神经抑制减弱不仅促进痫性发作的形成,而且有利于癫痫波的播散,具有坚实的实验基础。齿状回中,除兴奋性细胞外,还存在GABA能抑制性神经元分布。GABA能中间神经元不仅能够通过反馈和前馈机制维持齿状回神经网络的稳定,而且在认知功能上也起重要作用。与同一部位的兴奋性细胞在形态、电生理学性质以及功能上具有相对均一不同,GABA能中间神经元具有显著多样性。不管是在临床癫痫患者术后标本还是在癫痫模型动物都观察到齿状回GABA能中间神经元数目减少、形态和／或功能改变,只是出现改变的GABA能中间神经元亚型及其减少的程度有差异。与GABA能中间神经元数量改变相符,电生理学研究也发现有自发痫性发作的动物出现齿状回GABA能抑制的减弱。上述发现支持齿状回GABA能抑制减弱参与癫痫的形成。另外,除了GABA能中间神经元活动减弱导致癫痫形成的传统假说,已有实验证据显示GABA能中间神经元的激活还可能导致痫性发作的出现。那些在受到刺激后不需要任何新蛋白合成而出现表达上调基因被称为立早基因(immediate early genes, IEGs)。立早基因不管是在信使RNA水平还是在相关蛋白水平都可用来指示神经元活动及其强度。研究报道显示立早基因c-fos和活动调节细胞骨架相关蛋白(activity-regulated cytoskeleton associated protein, Arc or Arg3.1)在电休克刺激或者化学致痫药物诱发的痫性发作中出现活动性表达上调。但对IEGs表达能否用于研究痫性发作后GABA能中间神经元的激活尚未有结果。本课题使用大鼠匹罗卡品癫痫模型,在确认立早基因Arc和c-fos表达上调可用于反应GABA能中间神经元激活的基础上,通过脑片膜片钳记录和检测立早基因Arc和c-fos,研究了癫痫进展过程中齿状回GABA能神经元活动状态的改变。[主要方法]癫痫持续状态(status epilepticus, SE)的诱导通过腹膜腔内注射匹罗卡品诱导SE。将体重160-180 g(鼠龄6-7周)的健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠进行称重、分笼后,腹膜腔内给予特布塔林和东莨菪碱各2 mg/kg。为减少造模过程中动物死亡率,匹罗卡品分两次进行腹膜腔内注射。第一次剂量(150mg/kg)在特布塔林和东莨菪碱注射后30分钟后给予,第二次剂量(300mg/kg)在第一次注射的20分钟后给予。对照组动物分别在匹罗卡品相同注射时间点给予两次腹膜腔内生理盐水注射。在第二次剂量注射后开始观察动物行为改变,以Racine分级判断癫痫发作的严重程度。保留发作达Racine分级II级或以上以及连续发作时间2小时以上的动物进行后续实验。多聚甲醛经心脏灌流固定选取部分SE诱导后1小时、1周、2周以及10周以上(10-15周)和相同时间点的对照动物。称重后,腹膜腔内注射戊巴比妥钠(80mg/kg)将动物麻醉。完全麻痹后,将动物固定,快速打开腹腔和胸腔,充分暴露心脏。将灌流针头经左心室插入主动脉、剪开右心房,快速灌注30-50 ml肝素生理盐水(4单位/ml),随后以4%多聚甲醛PBS溶液对动物进行约40分钟的持续灌注(液体容积约为1 ml/kg)。灌流结束后将脑取出,以4%多聚甲醛PBS溶液在4℃下将脑后固定8-14小时。脑组织切片的制作将脑组织从4%多聚甲醛中依次转移至10%蔗糖PBS溶液中4小时,15%蔗糖PBS溶液中8小时,20%蔗糖PBS溶液中4℃过夜。梯度沉糖脱水后,将脑置于大鼠脑模具中,制成含有完整海马结构的组织块。将切好的脑组织块用卵白蛋白-明胶-戊二醛混合物进行包埋。包埋好的脑组织块用胶水粘于切片槽中,用振荡切片机切成40μm厚的水平切片。将腹侧海马切片按顺序收集到到预先加入1XPBS的48孔培养板中备用。Timm染色为确认模型制作的有效性,对部分动物的海马切片进行了Timm染色。对SE诱导10周后和相同时间点的对照动物各3只麻醉后分别进行经心脏灌流固定、取脑。脑组织在4%多聚甲醛中固定过夜后,以梯度增加的蔗糖溶液脱水、保护。将海马结构游离、快速冰冻后,用冰冻切片机制作30μm厚的水平脑切片。每隔6张取1张来自腹侧海马的脑片放置到PBS溶液中。将所取切片平铺于用多聚赖氨酸包被的载玻片上,置于切片盒中干燥、备用。将Timm's染色液倒入切片盒中,放在26℃恒温摇床中避光染色45分钟。用双蒸水清洗切片3次后,进行酒精梯度脱水、二甲苯透明。最后用中性树胶封片,晾干,以光学显微镜进行图像采集。免疫荧光染色将切片从1XPBS溶液转移至含有驴血清的封闭液中,4℃封闭2.5个小时以阻断非特异性结合位点。将切片转移至稀释好的各组一抗溶液(见材料与方法表格1.3)中4℃过夜。用1XPBS清洗切片3次,每次15分钟。将脑片转移至驴来源的由不同荧光色素标识的两种抗体中4℃下孵育2.5小时。用1XPBS清洗切片3次,每次15分钟。将切片平展至载玻片上,用75%甘油PBS溶液封片。共聚焦成像与图像分析用卡尔蔡司高灵敏度激光共聚焦显微镜LSM780对封好的切片进行拍摄。所有切片按照0.8倍图像缩放首先以10倍物镜拍摄并保存。随后将物镜转至20倍,以1.0缩放,随机在齿状同门区选取三个部位进行扫描、保存图像。所有图像拍摄在相同的扫描参数下完成。用Adobe Photoshop将齿状回门区背景色调暗,对阳性细胞进行计数。GABA能中间神经元的激活百分率通过c-fos阳性GABA能中间神经元数目/GABA能中间神经元总数X100%进行计算,而GABA能中间神经元不同亚群的激活则由c-fos阳性亚群细胞／相应亚群阳性细胞总数X100%计算。新鲜脑片的制作SE诱导至少10周后或相似年龄对照动物,给予乙醚吸入充分麻醉、铡刀断头。在冷却至4℃、95%O2/5%C02饱和的高镁人工脑脊液中快速将脑取出。用刀片将多余部分切除、制成含有腹侧和大部分背侧海马结构的脑组织块。以快速胶粘剂将组织块黏在切片槽底部,在95%02/5%CO2饱和的高镁人工脑脊液中,用振荡式切片机制成厚度为410 μm的水平面脑片。将切好的脑片转移至恒温(34.5℃).95%O2/5%CO2饱和的正常人工脑脊液中孵育30分钟。孵育完成后,将脑片孵育于95%O2/5%CO2饱和的常温人工脑脊液中保存备用。膜片钳记录将单片脑片转移至脑片记录槽底部,以95%O2/5%CO2饱和的人工脑脊液持续灌注脑片。先以5倍物镜发现齿状回后,以60倍水镜定位位于齿状回门区有复数突起的疑似中间神经元。高阻抗封接(2 GΩ)建立后,将细胞钳制在-60 mV,记录5分钟以观察细胞自发放电的有无以及其频率。负压吸破细胞膜进入全细胞记录模式后,立即读取静息膜电位数值。待电极内液和细胞内液充分交换,给予细胞长度为200 ms、幅度为10 mV的超极化方波刺激,记录细胞的电流波动。随后,在电流钳模式下,通过阶梯电流注射,记录放电。电流注射强度为-100 pA至300 pA,步增50 pA,每步时程为1秒。细胞被动电生理参数、阂电位、动作电位幅度、宽度以及后去极化电位等参数以PCLAMP10进行分析。生物素介导的细胞标识和细胞显像电生理记录结束、缓慢将玻璃电极撤离细胞。将脑片转移至4%多聚甲醛PBS溶液中在4℃下固定过夜。次日将脑片从4%多聚甲醛PBS溶液中依次转移至10%蔗糖PBS、15%蔗糖PBS和20%蔗糖PBS溶液中进行梯度沉糖、脱水。在用卵白蛋白-明胶-戊二醛混合物包埋后,用振荡切片机将脑片薄切至60 μm。将薄切后的脑片收集至1XPBS中保存备用。将脑片转移至含有2%过氧化氢和30%甲醇的水溶液中,室温孵育90分钟以灭活内源性过氧化物酶。用1XPBS清洗2次后,将其转移至亲和素-辣根过氧化物酶溶液中4℃下孵育过夜。用1XPBS清洗3次后,将脑片转移到使用前配制的二氨基联苯/过氧化氢/硫酸镍铵混合液中浸泡5-6分钟发色。显色完成后,将切片置于双蒸水中终止反应。用双蒸水反复清洗后,将切片平展于载玻片上、置室温下干燥过夜。以酒精梯度脱水、二甲苯透明后,用中性树胶将切片封入、镜检采集图像。统计学分析所有数据均采用均数±标准误表示(Mean±SEM),P≤0.05视为有统计学差异。进行统计检验前,所有数据均以Kolmogorov-Smirnov检验判断其分布特征。对符合正态分布的两组数据以非配对t检验进行比较,两组以上的数据以单因素或双因素方差分析进行统计学比较。单因素方差分析确认统计学差异存在后,以Dunnett法进行组间比较,双因素方差分析后以Bonferroni post hoc检验进行组间比较。不符合正态分布的两组数据以曼-惠特尼U检验进行比较。[主要结果]1.SE诱导齿状回苔藓发芽苔藓纤维主要分布于苔藓纤维正常走行的门区和CA3区,仅有极少量苔藓纤维分布于颗粒细胞层。而在SE诱导十周后,致密的苔藓纤维不仅在门区和CA3区存在,而且也出现于齿状回颗粒细胞层乃至内分子层,说明苔藓纤维发芽的存在。2.在蛋白水平,SE伴随立早基因表达的增加对急性痫性发作和SE诱导至少10周后动物齿状回进行立早基因Arc和c-fos的免疫荧光双染,结果显示：在急性痫性发作终止后和SE诱导10周后,Arc和c-fos的表达均出现显著上调,但其上调的方式显著不同。急性痫性发作1小时后,Arc和c-fos表达增强主要出现于颗粒细胞,而在SE诱导后10周以上的动物齿状回,门区细胞中的Arc和c-fos表达显著强于颗粒细胞。虽然Arc和c-fos的亚细胞分布不同,但不管是在对照动物还是SE诱导动物,在同一细胞中Arc和c-fos的表达强度在上述两个时间点都是平行的。3.SE诱导后,齿状回门区中间神经元立早基因表达的改变呈双向性使用四个不同时间点对照组和癫痫持续状态组动物海马切片,对c-fos与两种常用的GABA能中间神经元分子标志物谷氨酸脱羧酶67 (glutamic acid decarboxylase 67, GAD67)以及GABA进行免疫荧光双染。结果显示：c-fos在GABA阳性中间神经元的表达特征与c-fos在GAD67阳性细胞中的表达特征相似,但GABA的染色更强。对照组动物齿状回GABA能细胞表达c-fos的百分率较低,且各时间点GABA能阳性细胞表达c-fos的百分率没有显著统计学差异。而SE诱导后c-fos在GABA能神经元表达的增加呈双向性改变：急性痫性发作后诱导GABA能神经元中c-fos表达增加,但SE诱导1周后降至对照水平,2周后再度增加,10周后c-fos在GABA能中间神经元的表达最强、最广泛。4.SE诱导10周后,c-fos在齿状回GABA能中间神经元的表达上调具有细胞亚型特异性SE诱导10周后,c-fos和中间神经元神经分子标志物钙网膜蛋白(calretinin,CR)、神经元型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 、神经肽Y (neuropeptide Y, NPY)、生长抑素(somatostatin, SOM)和小白蛋白(parvalbumin, PV)双染显示：对照组中,各类中间神经元亚群表达c-fos的百分比从最高PV阳性细胞27.1%至最低CR阳性细胞14.9%不等。SE诱导10周后,除CR阳性细胞外,其它神经化学亚型的GABA能细胞表达c-fos的百分率均有显著增加,CR, nNOS, NPY, SOM和PV分另别增加9.9%、16.3%、46.2%、30.3%和19.0%。5.SE诱导10周后多数门区中间神经元出现自发放电对照组的9个细胞中包括1个篮状细胞、3个全分子层细胞(TML)、3个门区联合交通支相关细胞(HICAP)和2个门区穿通支相关细胞(HIPP),而SE诱导10周后的9个细胞中则包括1个篮状细胞、3个TML细胞、2个HICAP和3个HIPP细胞。对照组中,细胞接触式记录检测到9个细胞的2个细胞出现自发放电(22%)；而SE诱导10周后的9个中间神经元中的8个细胞呈现自发放电(89%)。统计分析显示SE诱导10周后的齿状回GABA能中间神经元自发放电频率显著高于相似时间点的对照组细胞。两组细胞在静息电位水平和阂电位水平上均无统计学差异。[结论]1.在匹罗卡品大鼠癫痫模型,经历潜伏期后存活下来的齿状回门区GABA能中间神经元呈持续激活。2.门区GABA能中间神经元的持续激活具有亚型特异性。3. GABA能中间神经元的持续激活反映了齿状回网络兴奋-抑制平衡的脆弱性,这可能是一种导致痫样活动产生的机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1;R-332
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本文编号：1823208