UC-MSCs通过IL-8促进大鼠神经功能修复的实验研究

发布时间：2018-05-02 17:00

本文选题：人脐带间充质干细胞 + 神经分化　；参考：《重庆医科大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分人脐带间充质干细胞基本生物学特性鉴定目的通过体外培养hUC-MSCs,鉴定其表面标志和神经分化能力,明确hUC-MSCs的基本生物学特性,为后续研究奠定基础。方法体外培养hUC-MSCs,倒置显微镜下观察不同培养代次(P2,P10,P15代)的细胞形态；通过染色体显带技术进行染色体核型分析,明确不同培养代次的hUC-MSCs染色带型稳定性；通过流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-ABC、CD34、 CD45和HLA-DR;在诱导神经分化方面,采用浓度为1 μmol/L的ATRA进行预诱导,然后利用改良成神经诱导液MNM进行神经分化诱导24h,得到神经分化状态的1UC-MSCs(用Dif表示),撤掉MNM诱导液24h后,再次给予MNM诱导24h得到神经再分化状态的hUC-MSCs(用Re-Dif表示),倒置显微镜观察hUC-MSCs,Dif和Re-Dif细胞形态；采用Western Blotting和Real-time PCR检测hUC-MSCs,Dif和Re-Dif三组细胞神经标志物NSE、MAP2、β-tubulinⅢ表达情况。结果(1)hUC-MSCs的培养及扩增：hUC-MSCs具有hMSCs的形态特征,细胞贴壁旋涡状生长,呈扁平梭形或细长针尖样,培养15代内均能保持干细胞的形态特征,细胞增殖能力较强,传代后3-4天可长满。(2)hUC-MSCs染色体显带分析：体外培养至第2代、第10代以及第15代的hUC-MSCs,染色体显带结果无异常,细胞传代至第15代仍能保持正常的染色体带型,不会发生染色体畸变。(3)hUC-MSCs流式技术鉴定：培养第3代的hUC-MSCs,99%以上的细胞阳性表达CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-ABC,阴性表达造血干细胞标志CD45和免疫原性标志HLA-DR。(4) hUC-MSCs神经分化、再分化诱导后形态变化：hUC-MSCs经神经分化诱导24h后,细胞形态较未经诱导的hUC-MSCs无明显变化,细胞仍呈现hMSCs的形态特征,细胞扁平呈梭形,旋涡状生长。但hUC-MSCs经神经再分化诱导24h后,细胞形态发生明显变化,呈现神经元样细胞形态,胞体收缩变圆而亮,细胞有单极或多极突起,部分突起连成网状,神经诱导率可达80-90%。(5)hUC-MSCs神经分化、再分化诱导后神经标志物表达情况：Real-time PCR结果显示,Dif组和Re-Dif组NSE、MAP2、 β-tubulinⅢ的表达均高于hUC-MSCs组,且Re-Dif组的表达高于Dif组,差异具有统计学意义(**P0.01,***P0.001, one-way ANO VA); Western Blotting检测结果与Real-time PCR结果一致。结论(1)hUC-MSCs具有hMSCs的形态特征和表面标志,细胞增殖能力较旺盛。(2)hUC-MSCs具有很好的生物学稳定性,体外多次传代不会对细胞染色体带型造成影响。(3)hUC-MSCs具有神经分化和再分化潜能,再分化hUC-MSCs较分化的hUC-MSCs表达更高的神经标志物。第二部分hUC-MSCs及分化、再分化hUC-MSCs移植测HIBD模型大鼠的神经修复作用目的利用新生SD大鼠建立HIBD模型,在体研究hUC-MSCs,分化及再分化hUC-MSCs移植对HIBD大鼠的神经保护作用。方法将134只7日龄健康SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=27)和HIBD造模组(HIBD组,n=1 07)；HIBD组大鼠行经典Rice法双结扎并离断左侧颈总动脉,并给予缺氧处理2.5h。Sham组大鼠仅分离并暴露左侧颈总动脉,但不结扎和离断也不给予缺氧处理；在建模后5d,将HIBD组实验大鼠随机分为PBS组(11=34)和细胞移植组(n=73),细胞移植组分为：未分化hUC-MSCs移植组(hUC-MSCs组,n=34),分化hUC-MSCs移植组(Dif组,n=21)和再分化hUC-MSCs移植组(Re-Dif组,n=18)；各组大鼠麻醉后固定,在脑立体定位仪指引下行颅内注射,每只实验大鼠给予细胞悬液量为5μL,细胞数量为2x105个,PBS组只给予5gL灭菌PBS颅内注射；细胞移植后2d,左侧脑组织石蜡切片行HE染色；颅内注射后1月,Morris水迷宫检测实验大鼠的学习记忆功能,Object-in-place行为学实验检测各组大鼠对新事物的探索能力,膜片钳记录实验大鼠海马脑片CA1区长时程增强电位情况。结果(1)hUC-MSCs移植对HIBD模型大鼠脑组织病理形态的影响：通过HE染色,HIBD组大鼠侧脑室周围脑组织疏松,呈现弥散状态,细胞核固缩呈空泡状。而经hUC-MSCs移植后,侧脑室周围脑组织较紧密,细胞核固缩、空泡情况较HIBD组改善,但仍达不到Sham组正常大鼠的脑组织形态特征。(2)hUC-MSCs移植对HIBD大鼠学习记忆功能的影响：Morris水迷宫实验发现,在第1d可见平台测试中,Sham (n=9), HIBD (n=18)和hUC-MSCs (n=17)三组大鼠找到平台所用时间和距离没有统计学差异,提示HIBD建模和细胞移植不会对大鼠的运动和视觉能力造成影响。第2-5d定位航行训练中,Sham, HIBD和hUC-MSCs三组大鼠找到平台所用时间均随着训练天数的增加而降低。HIBD组找到平台所用时间较Sham组明显增加,差异具有统计学意义(*P0.05,**P0.01,***P0.001, Sham vs. HIBD, one-way ANOVA),而hUC-MSCs移植后,hUC-MSCs治疗组找到平台所用时间较HIBD组明显缩短,差异具有统计学意义(#P0.05,HIBD vs. hUC-MSCs, one-way ANOVA)。第6d平台探索实验,hUC-MSCs治疗组找到平台次数明显多于HIBD组,但是仍少于Sham组(***P0.001, Sham vs. HIBD;*P0.05, HIBD vs. hUC-MSCs, Sham vs. hUC-MSCs)。(3) hUC-MSCs移植对HIBD大鼠新事物探索能力的影响：通过Object-in-place行为学实验,发现HIBD组(n=8)大鼠对新事物的探索能力明显低于Sham组(n=9),差异具有统计学意义(***P 0.001, Sham vs. HIBD)。而hUC-MSCs移植组(n=8)较HIBD组大鼠对新事物的探索能力明显提高,差异具有统计学意义(*P0.05, HIBD vs. hUC-MSCs)。(4) hUC-MSCs移植对HIBD模型大鼠海马脑片电生理功能的影响：通过膜片钳检测,发现Sham组,HIBD组和hUC-MSCs组实验大鼠海马脑片CA1区兴奋性突触后电位(fEPSPs)斜率在高频刺激(HFS)前20min的基线水平无差异,给予HFS刺激后,三组海马脑片fEPSPs斜率值均不同程度增加。HFS刺激后30min,HIBD组(110.1%±11.7% of baseline,n=5) fEPSPs斜率增加值明显低于hUC-MSCs移植组(153.1%±17.5% of baseline, n=6)和Sham组(167%±21.8% of baseline, n=6),差异具有统计学意义(*P0.05, HIBD vs. hUC-MSCs;***P0.001, HIBD vs. Sham)。(5)分化及再分化hUC-MSCs移植对HIBD大鼠学习记忆功能的影响：通过Morris水迷宫实验,在第1d可见平台测试中,hUC-MSCs组(]n=17),Dif组(n=12)和Re-Dif组(n=10)三组实验大鼠找到平台所用时间和距离没有统计学差异,说明三组间具有可比性。第2-5d定位航行训练中,三组大鼠找到平台所用时间无统计学差异(P0.05, one-way ANOVA)。第6d平台探索实验,尽管Dif组和Re-Dif组找到平台次数较hUC-MSCs组多,但差异仍不具有统计学意义(P0.05, one-way ANOVA)。(6)分化及再分化hUC-MSCs移植对HIBD大鼠新事物探索能力的影响：通过Object-in-place行为学实验,发现Dif组(n=9),Re-Dif组’(n=8)和hUC-MSCs组(n=8)三组大鼠对新事物的探索能力相当,三组间差异无统计学意义(P0.05, one-way ANOVA)。结论(1)hUC-MSCs移植可减轻HIBD模型大鼠脑组织病理形态改变。(2)hUC-MSCs移植可提高HIBD模型大鼠的空间学习记忆能力和对新事物的探索能力。(3)hUC-MSCs移植可以提高HIBD模型大鼠海马CA1区长时程增强电位。(4)hUC-MSCs、分化及再分化hUC-MSCs三种状态的细胞移植,都能促进HIBD模型大鼠空间学习记忆能力的恢复和提高大鼠对新事物的探索能力,但分化及再分化hUC-MSCs移植并没有较未分化的hUC-MSCs体现更大的神经修复潜能。第三部分hUC-MSCs通过IL-8促进HIBD模型大鼠学习记忆功能恢复第一章全基因表达谱芯片明确hUC-MSCs在神经分化、再分化过程中可能的分子机制目的运用全基因表达谱芯片阐明hUC-MSCs在神经分化和再分化过程中的具体分子机制；同时,揭示hUC-MSCs发挥体内修复作用的可能机制。方法利用Affymetrix U133真核生物全基因表达谱芯片检测hUC-MSCs、Dif及Re-Dif三种细胞的全基因表达情况；采用聚类分析对三组细胞的差异基因表达模式进行分析；通过GO生物学分析软件,分析差异基因参与的具体生物学功能；通过KEGG-pathway分析,明确差异基因参与的信号通路情况；通过对常见细胞因子基因表达情况分析,明确hUC-MSCs表达细胞因子情况。结果(1)Affymetrix U133真核生物基因表达谱芯片检测hUC-MSCs、Dif、Re-Dif三组细胞全基因表达模式：hUC-MSCs组基因表达模式与Dif组和Re-Dif组差异较大,呈现几乎对立的表达模式,而Dif组和Re-Dif组基因表达模式较接近。(2)hUC-MSCs、Dif、Re-Dif三组细胞连续变化的差异基因聚类分析：hUC-MSCs、Dif和Re-Dif三组中连续递增和连续递减的差异基因一共有483个,对这483个差异基因进行聚类分析,结果显示hUC-MSCs向Dif组分化以及向Re-Dif组再分化是一个连续变化的过程,其中Dif组处于中间过渡状态,而Re-Dif组呈现和hUC-MSCs组几乎完全对立的基因表达情况。(3)三组细胞连续变化的差异基因GO生物学功能分析：这483个差异基因主要参与的生物学功能包括信号转导、发育、负性细胞增殖、细胞周期、缺氧反应、神经系统发育、细胞分化以及炎症反应。(4)hUC-MSCs、 Dif、Re-Dif三组细胞连续变化的差异基因KEGG-Pathway分析：hUC-MSCs进行神经分化和再分化过程中有众多信号通路参与,主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用、P53信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路等,其中细胞因子-细胞因子受体相互作用是统计学差异最大的信号通路(P=-2.65E-10)。(5)全基因表达谱芯片检测hUC-MSCs细胞因子基因表达情况：hUC-MSCs表达许多细胞因子和趋化因子基因,TIMP-1、IL-8、CXCL1、TIMP-2、IL-1p、MCP-1、VEGF等细胞因子在hUC-MSCs中高表达。结论(1)hUC-MSCs与神经分化和再分化状态的hUC-MSCs具有不同的基因表达模式,而分化和再分化两种状态细胞的基因表达模式较相似。(2)hUC-MSCs进行神经分化和再分化诱导是一个动态变化的过程,再分化的hUC-MSCs较分化的hUC-MSCs呈现更成熟的终末基因表达状态。(3)hUC-MSCs进行神经分化和再分化诱导时,细胞因子参与的信号通路可能在其中发挥了主要作用。(4)TIMP-1、IL-8、 CXCL1、TIMP-2、IL-1β、MCP-1、VEGF等细胞因子可能与hUC-MSCs发挥治疗作用有关系。第二章hUC-MSCs分泌IL-8激活,INK信号通路促进HIBD大鼠海马血管生成目的探讨hUC-MSCs分泌IL-8参与HIBD模型大鼠神经修复的作用机制。方法实验设计分三组：正常对照组(Sham组,n=6), PBS颅内注射组(HIBD组,n=6)和hUC-MSCs移植组(hUC-MSCs组,n=6),在颅内注射后2d取脑组织进行各项检测；通过ELISA检测hUC-MSCs培养上清液中IL-8、TIMP-1、CCL2、CXCL1四种细胞因子表达情况,验证芯片结果；通过ELISA和Western Blotting检测Sham组、HIBD组和hUC-MSCs组三组实验大鼠脑组织hIL-8分泌水平和IL-8蛋白表达水平,以及CD31表达和VEGF分泌水平；通过CD31和BrdU双标免疫荧光实验,检测三组大鼠海马区血管生成情况；通过Western Blotting实验,检测三组大鼠脑组织JNK和p-JNK蛋白表达情况；通过siIL-8和GFP慢病毒转染,建立siIL-8-hUC-MSCs和GFP-hUC-MSCs稳定细胞株；通过Real-time PCR和Western Blotting实验,检测siIL-8-hUC-MSCs和GFP-hUC-MSCs两组细胞中IL-8基因和蛋白表达情况；将siIL-8-hUC-MSCs(n=14)和GFP-hUC-MSCs (n=14)稳定细胞株移植入HIBD大鼠体内,细胞移植后2d取脑组织进行检测；通过ELISA和Western Blotting实验,检测siIL-8-hUC-MSCs移植入HIBD大鼠脑组织后IL-8表达情况,以及CD31蛋白表达水平和VEGF分泌情况；通过CD31和BrdU双标免疫荧光实验,明确siIL-8-hUC-MSCs移植对海马区血管生成的影响；通过Western Blotting实验,检测JNK和p-JNK蛋白在siIL-8-hUC-MSCs组和GFP-hUC-MSCs组的表达情况；通过Morris水迷宫,检测siIL-8-hUC-MSCs组(n=8)和GFP-hUC-MSCs组(n=8)两组实验大鼠学习记忆功能情况。结果(1)hUC-MSCs分泌细胞因子情况：通过ELISA对芯片检测出最高的四种细胞因子进行验证,发现hUC-MSCs高分泌IL-8. TIMP-1、CCL2、CXCL1四种细胞因子,其中IL-8是最高分泌的细胞因子,其分泌量较其它三种细胞因子有统计学差异(***P0.001, IL-8 vs. TTMP-1, one-way ANOVA)。 (2) hUC-MSCs移植对IL-8表达水平的影响：通过对hUC-MSCs移植组大鼠脑组织在hIL-8分泌水平和IL-8蛋白水平进行检测,发现hUC-MSCs组表达IL-8水平高于HIBD组和Sham组,差异具有统计学意义(*P0.05, HIBD vs. hUC-MSCs, Sham vs. hUC-MSCs)。(3) hUC-MSCs移植对CD31和VEGF表达水平的影响：hUC-MSCs移植组CD31蛋白表达水平和VEGF分泌水平为三组中最高,高于 Sham组和HIBD组,差异具有统计学意义(**P0.01, HIBD vs. hUC-MSCs;**P0.01, Sham vs. HIBD)。(4) hUC-MSCs移植对血管生成的影响：hUC-MSCs治疗组海马新生血管明显多于HIBD组,差异具有统计学意义(*P0.05, HIBD vs. hUC-MSCs, Sham vs. HIBD, one-way ANOVA)。(5) hUC-MSCs移植促进血管生成的可能机制：hUC-MSCs组p-JNK蛋白表达水平较HIBD组和Sham组明显增高,但JNK总蛋白表达水平在三组没有明显差异。(6)siIL-8-hUC-MSCs细胞株的建立：通过倒置荧光显微镜观察,发现GFP空载慢病毒组和siIL-8'慢病毒组感染细胞稳定表达绿色荧光,与普通光学显微镜下的细胞相比,GFP组和siIL-8组慢病毒感染率均达85%以上,两组间无明显差异,并且病毒感染组细胞活力及增殖能力较未感染病毒的hUC-MSCs无明显减弱。(7)siIL-8-hUC-MSCs稳定细胞株的鉴定：Real-time PCR显示,siIL-8-hUC-MSCs组IL-8基因表达水平明显低于GFP-hUC-MSCs组,差异具有统计学意义(***p0.001, Student's t test)。IL-8蛋白表达水平与基因水平一致。(8)siIL-8-hUC-MSCs移植对IL-8表达水平的影响：siIL-8-hUC-MSCs组大鼠脑组织中hIL-8分泌水平较GFP-hUC-MSCs组明显降低,差异具有统计学意义(***P 0.001, Student's t test)。IL-8蛋白表达水平与hIL-8分泌水平一致。(9)siIL-8-hUC-MSCs移植对CD31和VEGF蛋白表达水平的影响：siIL-8-hUC-MSCs移植组在CD31蛋白表达和VEGF分泌水平均较GFP-hUC-MSCs移植组低,差异具有统计学意义(*P0.05, Student's t test)。(10) siIL-8-hUC-MSCs移植对海马区血管生成的影响：siIL-8-hUC-MSCs移植组海马区BrdU+/CD31+细胞数量明显少于GFP-hUC-MSCs移植组,对阳性标记的新生血管进行计数,差异具有统计学意义(*P0.05, Student's t test)。(11) siIL-8-hUC-MSCs移植对JNK信号通路的影响：siIL-8-hUC-MSCs组p-JNK蛋白表达水平明显低于GFP-hUC-MSCs组,而总JNK蛋白表达水平在两组无差异。(12)siIL-8-hUC-MSCs移植对HIBD模型大鼠学习记忆功能的影响：通过Morris水迷宫检测,发现siIL-8-hUC-MSCs移植组大鼠穿越平台次数明显少于GFP-hUC-MSCs组,差异具有统计学意义(*P0.05, Student' s t test)。结论(1)hUC-MSCs分泌的IL-8可能通过JNK信号通路参与HIBD大鼠海马区血管生成。(2)体外成功建立siIL-8-hUC-MSCs和GFP-hUC-MSCs稳定细胞株。(3)利用siIL-8-hUC-MSCs反向证实hUC-MSCs移植通过分泌IL-8促进HIBD大鼠学习记忆功能的恢复。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741

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