RBFOX1高表达与皮质发育障碍伴难治性癫痫发病机制的临床及细胞学研究

发布时间：2018-05-08 14:21

  本文选题：Rbfox1 + 癫痫　； 参考：《重庆医科大学》2014年博士论文

【摘要】：目的：探索皮质发育障碍伴难治性癫痫患者脑内病灶组织中RBFOX1蛋白的表达情况；采用慢病毒介导的Rbfox1基因过表达和沉默技术，建立离体培养的大鼠原代神经元Rbfox1基因过度表达与沉默模型，研究不同水平的Rbfox1蛋白对神经元兴奋性的影响及可能机制。 方法：收集皮质发育障碍伴难治性癫痫患者脑内病灶组织（本实验取颞叶皮质为研究对象），对照组为重型颅脑外伤患者因颅内压高行内减压术切除的非挫伤区的颞叶皮质。采取免疫组化和Western blot技术检测皮质发育障碍伴难治性癫痫患者脑内病灶组织中RBFOX1蛋白的表达情况。 采取慢病毒介导的Rbfox1基因过表达和沉默技术制备原代神经元Rbfox1基因过表达与沉默模型，采用RT-qPCR技术、Western blot技术和免疫荧光技术验证慢病毒转染效率。采用膜片钳技术检测Rbfox1基因表达改变后原代神经元的兴奋性改变。同时采用Western blot技术和免疫荧光技术检测Rbfox1基因表达改变后原代神经元内Rbfox1蛋白的下游靶基因包括NMDA受体1(Grin1), GABA-A受体γ2(Gabrg2)和钠通道Na(v)1.6(Scn8a)基因表达的改变。 结果：在皮质发育障碍伴难治性癫痫患者脑内病灶组织中，RBFOX1蛋白表达上调。膜片钳技术检测Rbfox1蛋白表达水平不同的神经元兴奋性时发现：1.Rbfox1过表达组的神经元动作电位幅度和钠电流密度值较Rbfox1沉默组、空病毒组以及对照组都显著增高，，差异具有统计学意义。2.仅我们做膜片钳观察的有限时间内，我们发现26.32%的Rbfox1过表达组神经元出现了自发的、反复发生的癫痫样放电。3.Rbfox1沉默组的神经元也表现出类似的结果，但不及Rbfox1过表达组明显。Rbfox1过表达组神经元动作电位波幅比Rbfox1沉默组神经元增高近9mV，差异具有统计学意义(P0.05, ANOVA继之以LSDtest)；Rbfox1过表达组出现自发的癫痫样放电的神经元比例比Rbfox1沉默组增高约10%，癫痫样放电的频率也明显增高。4.一些与癫痫有关的Rbfox1蛋白的靶基因蛋白产物随着原代神经元内Rbfox1蛋白表达的改变（上调以及下调）而出现表达上调，包括NMDA受体1(Grin1),GABA-A受体γ2(Gabrg2)以及钠通道Na(v)1.6(Scn8a)。 结论：1.皮质发育障碍伴难治性癫痫患者的脑内病灶组织中RBFOX1蛋白表达显著增高；过表达Rbfox1蛋白的神经元兴奋性比Rbfox1表达抑制以及对照组的神经元都显著增高，提示Rbfox1蛋白表达上调可能参与了调控神经元的兴奋性，可能参与了癫痫的发病。2.过表达Rbfox1蛋白的神经元兴奋性增高可能与SNAP-25，钠通道Na(v)1.6，NMDA受体1等和细胞兴奋性有关的蛋白表达上调有关。
[Abstract]:Objective: to investigate the expression of RBFOX1 protein in brain tissue of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy, and to investigate the expression and silencing of Rbfox1 gene mediated by lentivirus. In order to study the effect of different levels of Rbfox1 protein on neuronal excitability and its possible mechanism, a model of overexpression and silencing of Rbfox1 gene in primary neurons in vitro was established to study the effects of different levels of Rbfox1 protein on neuronal excitability. Methods: the focal tissues of cerebral lesions in patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy were collected. In this experiment, the temporal lobe cortex was selected as the study object, and the control group was the temporal cortex of the non-contusive area in the severe craniocerebral trauma patients which had been resected by internal decompression due to intracranial hypertension. Immunohistochemical and Western blot techniques were used to detect the expression of RBFOX1 protein in brain tissue of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy. The lentivirus-mediated overexpression and silencing of Rbfox1 gene were used to prepare the primary neuron model of Rbfox1 gene overexpression and silencing. The efficiency of lentivirus transfection was verified by RT-qPCR technique, Western blot technique and immunofluorescence technique. Patch clamp technique was used to detect the excitability of primary neurons after the change of Rbfox1 gene expression. At the same time, Western blot and immunofluorescence techniques were used to detect the downstream target genes of Rbfox1 protein in primary neurons, including NMDA receptor 1, GABA-A receptor 纬 2, Gabrg2, and sodium channel, Nav 1. 6, Scn8a). Results: the expression of RBFOX1 protein was up-regulated in the lesions of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy. Patch clamp technique was used to detect the excitability of neurons with different expression levels of Rbfox1 protein. It was found that the amplitude of action potential and sodium current density of neurons in the overexpression group of Rbfox1 were significantly higher than those in the Rbfox1 silencing group, the empty virus group and the control group. The difference was statistically significant. Only in the limited time we did patch clamp observation, we found that 26.32% of neurons in the Rbfox1 overexpression group showed spontaneous and recurrent epileptic discharges. 3. The neurons in the Rbfox1 silencing group showed similar results. But the amplitude of action potential of neurons in the overexpression group of Rbfox1 was 9 MV higher than that in the group of Rbfox1 silencing, and the difference was statistically significant (P 0.05). The frequency of spontaneous epileptiform discharges in ANOVA group was higher than that in the group with Rbfox1 overexpression. Compared with Rbfox1 silencing group, the frequency of epileptiform discharge was increased by 10% and 4. 4% respectively. The target protein products of some Rbfox1 proteins associated with epilepsy were up-regulated with the changes (up-regulation and down-regulation) of Rbfox1 protein expression in primary neurons, including the expression of GABA-A receptor 纬 _ 2GABA-A receptor 纬 _ 2Gabrg _ 2 and sodium channel Na _ (v) ~ (1.6) / Scn _ (8aN) in primary neurons. Conclusion 1. The expression of RBFOX1 protein in brain lesions of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy was significantly increased, the excitability of neurons overexpression of Rbfox1 protein was significantly higher than that of Rbfox1 expression inhibition and the neurons of control group were significantly higher than those of control group. These results suggest that the up-regulation of Rbfox1 protein may be involved in the regulation of neuronal excitability, and may be involved in the pathogenesis of epilepsy. The increase of neuronal excitability of overexpression of Rbfox1 protein may be related to the up-regulation of SNAP-25, Na ~ + channel Navn ~ (1.6) NMDA receptor _ 1 and protein expression related to cell excitability.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

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本文编号：1861746