miR-125b在神经胶质瘤中的作用及机制研究

发布时间：2018-05-11 16:49

本文选题：microRNA + 胶质瘤　；参考：《吉林大学》2014年博士论文

【摘要】：本实验以人胶质瘤组织标本、胶质瘤细胞系以及裸鼠荷瘤模型为研究对象，研究miR-125b在胶质瘤细胞中的表达，，以及其对胶质瘤生物学功能的影响和潜在分子机制。本实验共分3部分： 1. miR-125b在神经胶质瘤患者外周血和瘤体中的表达及临床意义 MicroRNA是一类长约18-25nt，非编码的单链小RNA分子，与特定mRNA结合后可在转录后水平调节基因的表达。研究证实，microRNA与胶质瘤的关系密切。本研究收集我院住院手术胶质瘤患者的瘤组织，提取RNA后经deepsequencing检测，结果显示与正常脑组织相比，胶质瘤中约有34种miRNAs水平下调4倍以上，46种miRNAs上调4倍以上。其中，miR-125b在瘤体内上调较为明显。为进一步对microRNA谱筛选结果进行验证，我们利用qRT-PCR检测miR-125b在胶质瘤患者外周血清和瘤体内的表达。结果显示，胶质瘤患者外周血清和瘤体内miR-125b水平均明显高于正常成人（p0.01）。为进一步研究miR-125b的临床意义，我们对胶质瘤标本进行了Ki67评分并研究其与miR-125b表达的相关性，结果显示miR-125b与Ki67评分呈正相关，并且肿瘤内高miR-125b表达患者肿瘤复发时间要明显早于肿瘤内低miR-125b表达的患者。这些结果表明miR-125b在胶质瘤患者体内表达上调，并与肿瘤恶性程度以及疾病预后相关。 2.miR-125b促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭及抗凋亡能力在第一部分研究中，我们发现miR-125b与肿瘤恶性程度以及疾病预后相关，但其对胶质瘤生物学功能的影响还待进一步研究。因此，在本研究中，我们在miR-125b对胶质瘤细胞体内外增殖、抗凋亡能力和侵袭性的影响方面做了系统研究。我们将miR-125b的激动剂agomir-125b和其阴性对照agomir-NC转染至U87和U251细胞后，每24h进行1次MTT检测。结果显示，转染agomir-NC的U87和U251细胞在各时间段吸光度与对照组相比无明显差异（p0.05），而转染了agomir-125b的U87和U251细胞在48h时吸光度明显高于对照组（p0.01），在72h和96h时高于对照组（p 0.05）。同时我们还进行了细胞克隆形成实验，结果发现转染agomir-125b的U87细胞在体外成克隆数目明显多于普通对照组（control）和其阴性对照（agomir-NC）（p 0.05），而agomir-NC组与control组相比无明显差异（p0.05）。为研究miR-125b对胶质瘤细胞侵袭能力的影响，我们进行了细胞划痕实验和Transwell小室实验。结果显示，转染miR-125b的U87细胞的迁移距离明显长于其阴性对照组（p0.05）。并且，转染miR-125b的U87细胞穿过基质胶和滤膜的平均数目也明显多于其阴性对照组（p0.01）。这些结果说明miR-125b可增强胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力。为研究miR-125b对胶质瘤细胞抗凋亡能力的影响，我们将替莫唑胺（TMZ）作为肿瘤细胞的凋亡诱导剂，然后通过Hoechst33258染色以及western blot对转染miR-125b的U87细胞的凋亡情况进行检测。结果显示，在TMZ存在情况下，转染miR-125b的U87细胞凋亡数目明显少于其阴性对照组（p0.05）。并且western blot检测结果显示，转染miR-125b的U87细胞中两个凋亡相关蛋白PARP和caspase3表达水平明显低于阴性对照组（p0.05）。这些结果说明miR-125b可增强胶质瘤细胞对化疗药物刺激的抗凋亡能力。同时，我们还将转染了agomir-NC、agomir-125b的C6细胞和普通C6细胞（control）分别注射至裸鼠的皮下，连续测量肿瘤的生长情况。结果发现，从第5天开始，agomir-125b组的胶质瘤体积明显大于阴性对照组（p0.05）。此结果说明agomir-125b可促进在体胶质瘤细胞成瘤和生长。以上结果显示miR-125b具有促进胶质瘤细胞生长、成瘤、侵袭和抗凋亡的作用，具有重要的研究意义，但其具体作用机制还待进一步研究。 3.miR-125b通过抑制靶点Cx43表达发挥对胶质瘤生物学特性的影响为研究miR-125b影响胶质瘤生物学特性的机制，我们通过miRbase、Targetscan和microRNA.org三种软件预测miR-125b的作用靶点，结果发现Cx43mRNA的3’UTR端包含一个7mer大小的序列与miR-125b相匹配。为了确定这些序列与miR-125b结合后可下调Cx43mRNA的翻译，我们将含此位点的Cx43mRNA3’UTR构建入luciferase报告系统（Cx43-3’UTR-wt），同时将突变后的Cx43mRNA3’UTR也插入luciferase报告系统中（Cx43-3’UTR-mut）。然后将miR-125b与luciferase空质粒（empty vector）或Cx43-3’UTR-wt质粒或Cx43-3’UTR-mut质粒共同转染至HEK-293细胞中，检测各组细胞中的荧光强度。并且，我们将miR-125bmimic及其阴性对照mimic-NC、miR-125b inhibitor及其阴性对照inhibitor-NC转染至U87细胞中，western blot检测Cx43水平。结果发现Cx43-3’UTR-wt组荧光强度明显低于其阴性对照组（miR-con），而Cx43-3’UTR-mut组或空质粒组荧光强度与其阴性对照无明显差异；miR-125b mimic可显著降低U87细胞中Cx43水平（p0.05），而miR-125b inhibitor可显著升高U87细胞中Cx43水平（p 0.05）。为确定Cx43是否参与了miR-125b对胶质瘤细胞生物学行为的改变作用，我们还构建了过表达Cx43的U87胶质瘤细胞，进一步研究miR-125b对过表达Cx43的U87细胞生物学行为的影响。结果发现，同时转染miR-125b，Cx43过表达U87细胞形成克隆的能力明显低于其阴性对照（p0.05）。并且Cx43过表达U87细胞抗TMZ诱导凋亡的能力均明显低于其阴性对照（p0.05）。此结果表明miR-125b可以通过与Cx43mRNA3’UTR端结合而调节其蛋白表达水平，过表达Cx43可阻断miR-125b对神经胶质瘤细胞生长和抗凋亡能力的影响，证明其参与了miR-125b改变胶质瘤细胞生物学行为的作用。
[Abstract]:In this experiment , human glioma tissue samples , glioma cell lines and nude mice bearing tumor models were used as the research objects to study the expression of miR - 125 in glioma cells , as well as their effects on the biological function of glioma and potential molecular mechanisms .

Expression and Clinical Significance of the Expression of 1 . miR - 5 in Peripheral Blood and Tumor of Patients with glioma

MicroRNA was a kind of single - stranded small RNA molecule of about 18 - 25nt , which was non - coding single - stranded small RNA molecule , and can regulate the expression of gene at post - transcriptional level after binding with specific mRNA .

2 . The proliferation , invasion and anti - apoptotic ability of glioma cells

In the first part of the study , we have found that the effects of miR - 125 on the biological function of glioma have to be further studied . Therefore , in the present study , we have done a systematic study on the effects of miR - 125 on the proliferation , anti - apoptotic ability and invasion ability of glioma cell bodies .

The results showed that U87 and U251 cells transfected with agomir - NC showed no significant difference compared with the control group ( p < 0.05 ) , and the absorbance of U87 and U251 cells transfected with agomir - NC was significantly higher than that of the control group at 48 hours ( p < 0.05 ) . The results showed that the expression level of the U87 cells transfected with miR - 125 was significantly lower than that of the negative control group ( P < 0.05 ) .

The above results show that miR - 812has the function of promoting glioma cell growth , tumor formation , invasion and anti - apoptosis , and has important research significance , but the specific mechanism of action is further studied .

3 . The effect on the biological characteristics of glioma by inhibiting the expression of Cx43 in the target

In order to determine the expression of Cx43 mRNA and its negative control inhibitor - NC , we detected the expression of Cx43 mRNA and its negative control inhibitor - NC .
The level of Cx43 in U87 cells was significantly decreased ( p < 0.05 ) , while the level of Cx43 in U87 cells was significantly increased ( p 0.05 ) .

In order to determine whether Cx43 was involved in the biological behavior of human glioma cells , we also constructed U87 glioma cells expressing Cx43 , and further studied the effect of miR - 12s on the biological behavior of U87 cells expressing Cx43 .

The results show that miR - 125 can regulate the protein expression level of glioma cells by binding to the terminal of Cx43mRNA3 ' , and the overexpression of Cx43 can block the influence of miR - 12s on the growth and anti - apoptotic ability of glioma cells . It is shown that it is involved in the biological behavior of glioma cells .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

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