NGR修饰的载阿霉素二氧化硅纳米粒抗胶质瘤的实验研究

发布时间：2018-05-14 08:52

  本文选题：介孔二氧化硅 + 聚多巴胺　； 参考：《重庆医科大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分NGR修饰载DOX的二氧化硅纳米粒制备及检测目的选用阿霉素(DOX)为目标药物,介孔二氧化硅(MSN)作为药物载体,经聚多巴胺(PDA)涂层包裹,Asn-Gly-Arg(NGR)肽作为靶向配体并与PDA共价结合,制备一种新型的针对胶质瘤及肿瘤血管内皮双靶向性纳米粒(MSN-DOX-PDA-NGR),并对其表征和特性进行鉴定和检测。方法将MSN与DOX溶液室温下混合搅拌,使DOX进入MSN的介孔中,分离纯化并真空干燥后与盐酸多巴胺反应,使MSN-DOX表面包被一层聚多巴胺外壳,得到MSN-DOX-PDA,洗涤后将MSN-DOX-PDA加入到NGR水溶液中,使NGR与聚多巴胺外壳共价结合,得到MSN-DOX-PDA-NGR。分别检测微粒的粒径、Z电势,计算载药量,并测定不同p H值下药物的释放速度。结果电子显微镜检测出微粒的直径为160.1±1.49nm,表面电位为-22±0.97m V。通过分光光度法检测微粒制备过程中未包被的DOX量计算出DOX载药率和包封率分别为19.02%和40.84%。体外释药实验显示DOX在中性环境下释放率极低,在酸性环境下释放速度快,24小时累计释放率可达到近50%。结论本研究成功制备出一种平均粒径约160nm的载DOX纳米粒,有较高的载药率和包封率,能在中性环境下稳定存在,酸性环境下稳定释放,为下一步实验奠定了基础。第二部分MSN-DOX-PDA-NGR双靶向性的体外研究目的对成功构建的MSN-DOX-PDA-NGR双靶向纳米粒进行一系列的体外评价:细胞摄取实验、细胞毒性实验、竞争抑制实验、细胞摄取机制实验、亚细胞定位实验,体外血脑屏障(BBB)模型实验,以此评估纳米粒对胶质瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞的毒性及双靶向性。方法培养大鼠胶质瘤细胞株(C6),原代分离培养大鼠星形胶质细胞(AC)、大鼠脑血管内皮细胞(BCEC),用transwell建立BCEC-C6及BCEC-AC共培养体系,用流式细胞技术及western blotting法检测C6、AC、BCEC、BCEC-C6、BCEC-AC这五种细胞中CD13的表达量。用流式细胞技术及激光共聚焦分别定量定性检测C6及BCEC-C6对MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA-NGR+free NGR的摄取作用,以评估纳米粒的细胞双靶向性及竞争抑制作用。用CCK-8法检测free DOX、MSN-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA-NGR+free NGR的细胞毒性作用,计算出IC50值来评估载药纳米粒的细胞毒性及空载体的生物安全性。同时,选取人胶质瘤细胞株(U251)、小鼠胶质瘤细胞株(GL261)进行细胞摄取实验和细胞毒性实验,用以评估纳米粒在不同种属间的细胞靶向性和细胞毒性。用流式细胞技术检测预孵了各种抑制剂的C6及BCEC-C6细胞摄取MSN-DOX-PDA-NGR后的荧光强度,以探索细胞的摄取机制。用激光共定位技术观察纳米粒和溶酶体在细胞内的相对位置,探索纳米粒的亚细胞定位。用高效液相色谱法检测体外血脑屏障模型中各种DOX制剂的跨BBB比率,以评估纳米粒对BBB的穿透能力。用流式细胞技术检测共培养模型中C6细胞对纳米粒的摄取,用CCK-8法检测纳米粒对C6细胞的毒性作用,以评估纳米粒跨膜后的靶向能力和细胞毒性作用。结果C6、BCEC-C6细胞中的CD13表达量明显高于AC、BCEC、BCEC-AC。定性定量结果均显示MSN-DOX-PDA-NGR对C6、BCEC-C6、U251细胞的特异识别能力显著高于MSN-DOX-PDA;加入free NGR预孵后,MSN-DOX-PDA-NGR对靶细胞的特异识别和摄取能力被竞争性抑制,但在GL261细胞中没有得到类似的结果。细胞毒性实验中,DOX制剂的细胞毒性作用呈浓度及时间依赖性。空载体MSN-PDA-NGR的浓度在达到1000μg/ml,孵育时间达到96小时的情况下,细胞活力仍高于80%。对C6细胞而言,DOX、MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR、MSN-DOX-PDA-NGR+free NGR 24小时的IC50值分别是16.90、138.1、5.09、59.71μg/m L,48小时的IC50值分别是7.608、9.85、1.74、10.61μg/m L。与无NGR修饰的MSN-DOX-PDA比较,NGR的修饰能显著降低MSN-DOX-PDA-NGR的IC50值,孵育24小时降低27.13倍,孵育48小时降低5.66倍;游离NGR的预处理能显著提高MSN-DOX-PDA-NGR的IC50值,24小时提高11.7倍,48小时提高6.1倍。对于BCEC-C6、U251细胞,各处理组间的IC50值有相同的趋势;对于GL261细胞,未发现各处理组间的IC50值存在显著差异(P0.05)。在细胞摄取机制实验中,流式细胞技术显示Na N3(能量消耗剂),Cyto-B(大胞饮抑制剂),CPZ(网格蛋白介导的内吞抑制剂)和莫能菌素(溶酶体抑制剂)组的C6细胞荧光强度比对照组显著降低(P0.05),而filipin和genistein(小凹介导的内吞抑制剂)以及BFA(高尔基体和胞内转运抑制剂)组的C6细胞荧光强度相对于对照组无显著差异(P0.05);对于BCEC-C6细胞,仅genistein组细胞的荧光强度与对照组无显著差异(P0.05)。激光共定位实验进一步证明了纳米粒进入细胞后定位于溶酶体。在体外BBB模型中,孵育12小时后,MSN-DOX-PDA和MSN-DOX-PDA-NGR的跨BBB转移率分别是13.16%和24.59%,差异有显著性;预孵游离NGR后,MSN-DOX-PDA-NGR的跨BBB转移率显著降低。在体外共培养模型中,流式细胞技术显示MSN-DOX-PDA-NGR与共培养体系中的C6细胞结合最多,CCK-8实验显示MSN-DOX-PDA-NGR的毒性最大。结论载体MSN-PDA-NGR的细胞毒性作用很小,MSN-DOX-PDA-NGR具有双靶向C6和BCEC-C6的能力,为下一步体内实验奠定了基础。第三部分MSN-DOX-PDA-NGR双靶向性的的体内研究目的建立C6胶质瘤体内模型,尾静脉注射DOX、MSN-DOX-PDA、MSN-DOX-PDA-NGR,研究各种DOX制剂在体内重要脏器中的分布情况及抗瘤效果,观察模型鼠的肿瘤生长情况并计算生存期,评估体内应用的生物安全性。方法首先建立裸鼠胶质瘤模型,尾静脉注射各种DOX制剂后,在动物活体荧光成像系统下于设定时间点观察活体组织及离体脏器各DOX制剂的分布情况。然后用荧光显微镜观察MSN-DOX-PDA及MSN-DOX-PDA-NGR在大鼠胶质瘤模型中脑组织及肿瘤组织内的分布情况。用HPLC法检测模型鼠中左右大脑半球及肝脏组织内DOX的含量。用HE染色法及免疫组化法观察双靶向纳米粒的抗肿瘤及抗肿瘤血管的活性,记录生理盐水组,DOX组,MSN-DOX-PDA组,MSN-DOX-PDA-NGR组模型鼠的生存时间。用载体MSN-PDA-NGR注射成年健康雄性大鼠,记录体重变化,并将主要脏器行HE染色以评估载体的生物安全性。结果与MSN-DOX-PDA相比,MSN-DOX-PDA-NGR能更多地聚集于脑肿瘤区域。定量实验显示MSN-DOX-PDA-NGR组中荷瘤侧大脑半球的DOX含量显著高于正常侧大脑半球,而肝脏的DOX含量无显著差异。HE染色及免疫组化结果提示MSN-DOX-PDA-NGR组的肿瘤坏死、凋亡面积最大,肿瘤血管数量显著减少。生存曲线显示生理盐水组、DOX组、MSN-DOX-PDA组、MSN-DOX-PDA-NGR组中大鼠的中位数生存时间分别是19天、21天、21.5天、32天。MSN-DOX-PDA-NGR治疗能显著延长中位生存时间。用载体MSN-PDA-NGR及生理盐水静脉注射后,两组的体重增长情况无明显差异,HE染色显示心、肝、脾、肺、肾无明显的病理性坏死或损伤。结论MSN-DOX-PDA-NGR能突破血脑屏障分布于肿瘤组织中,并产生明显的抗肿瘤及抗肿瘤血管活性,具有很好的生物安全性。
[Abstract]:A new type of nano - particle with average particle size of 160nm was prepared by mixing MSN with the solution of poly - dopamine . The results showed that the release rate of the nanoparticles was 160.1 卤 1.49nm , the surface potential was -22 卤 0.997 mV . The results showed that the release rate of the nanoparticles was 160.1 卤 1.49nm , the surface potential was -22 卤 0.997 mV . The cytotoxic effects of nanoparticles and lysosomes on C6 , BCEC - C6 and U251 cells were evaluated by flow cytometry . The IC50 values of the cells were determined to be 16.90 , 138.1 , 5.09 , 59.71 渭g / ml , respectively . The results showed that there was no significant difference in the cross - BBB transfer rate between the two groups , such as normal saline group , group A - PDA - NGR and MSN - GPDA - NGR . Conclusion : The results showed that there was no significant difference in the cross - BBB transfer rate between the two groups .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

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