鞘内注射scAAV9-hIGF1对ALS小鼠模型运动神经元保护作用及机制研究

发布时间：2018-05-17 12:45

本文选题：肌萎缩侧索硬化 + 转基因小鼠　；参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种慢性、进行性、致死性神经变性疾病,发病率约为5/10万至7/10万,临床患者约90%为散发性肌萎缩侧索硬化(SALS),余为家族性肌萎缩侧索硬化(FALS),二者的临床表现及病理特点相似,患者一般在出现症状后的3~5年内病情进行性加重,最终因肌肉萎缩无力、呼吸衰竭而死亡。目前尚无有效的治疗方法。SALS的病因还不明确。经大量的FALS患者研究证实,20%的病例由铜/锌超氧化物歧化酶1基因(SOD1)突变引起。G93A-SOD1转基因小鼠(ALS小鼠)模拟人类ALS疾病的临床特点,被用作研究ALS病理机制的工具鼠。高拷贝数转基因G93A-SOD1小鼠约在12周龄时后肢开始出现运动功能障碍症状,并逐渐进展,约17-20周龄发展到终末,病理表现与人ALS相似的致命的运动神经元的变性。研究认为突变的SOD1蛋白错误折叠,易形成聚集体,对降解短寿命蛋白质的泛素蛋白酶体系统抵抗,具有细胞毒性,是导致家族性ALS疾病的机制之一。自噬(autophagy)可以清除长寿命蛋白质、错误折叠蛋白质及衰老损伤细胞器,是高度保守的细胞生物学行为。在中枢神经系统,自噬是清除错误折叠蛋白的重要途径,以维持神经元的正常生理功能。因此研究有效降解突变SOD1蛋白对ALS疾病治疗具有重要意义。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF1)含有70个氨基酸,是一种在分子结构上与胰岛素类似,相对分子质量为7 649,通过内分泌、自分泌和旁分泌的三种途径产生的低分子多肽。IGF-1参与生物体内多种重要生理功能,其重要作用之一是有助于修复神经的损害。应用腺相关病毒血清2型(adeno-associated virus 2,AAV2)携带人单链IGF1基因(AAV2-hIGF1)肌肉注射经神经逆轴浆运输干预G93A-SOD1转基因小鼠,其发病明显推迟、生存期延长,研究发现IGF1激活ALS小鼠的脊髓运动神经元自噬通路,抑制运动神经元凋亡,从而保护了运动神经元,该实验没有报道突变的sod1蛋白水平变化,我们推测可能是在自噬激活参与下使致病的sod1蛋白水平下调减轻了对运动神经元的毒性。本研究我们应用亲神经的腺相关病毒血清9型(aav9)携带编码双链的higf1基因(scaav9-higf1)经鞘内注射的途径干预g93a-sod1转基因小鼠,观察其行为学变化,探索表达higf1对als小鼠突变sod1蛋白表达及病理的影响,并进一步采用crispr-cas9系统,通过给g93a-sod1转基因雌性小鼠鞘内注射scaav9-sgrna-igf1-cas9以敲降小鼠自身igf1,探索对als小鼠突变sod1蛋白表达及病理是否呈反方向影响。我们查阅国内外文献类似报道极少。第一部分鞘内注射scaav9-higf1对als小鼠模型行为学及突变sod1蛋白的影响目的:我们应用亲神经性的腺相关病毒血清型9(aav9)携带编码双链的人igf1基因(scaav9-higf1)经鞘内注射途径干预60天龄、90天龄g93a-sod1转基因雌性小鼠,观察干预后其行为学变化,研究表达higf1对als小鼠突变sod1蛋白表达及病理的影响。方法:我们选取美国jackson实验室提供的肌萎缩侧索硬化转基因g93a-sod1小鼠为动物模型,应用其提供的引物序列和鉴定方法对转基因g93a-sod1仔鼠进行dna鉴定,阳性的g93a-sodl转基因雌性小鼠经同窝配对作为受试对象。60天龄时、90天龄时的g93a-sod1转基因阳性同窝雌性小鼠随机分配到药物治疗组鞘内注射scaav9-higf1,对照组鞘内注射aav9-gfp,各15对。另外选取60天龄时g93a-sod1转基因阳性同窝雌性小鼠10对,随机分别给予鞘内注射scaav9-higf1/aav9-gfp,其中3对鞘内注射3周时新鲜取材提取蛋白,采用酶联免疫吸附实验观测转染后higf1表达、分布特点,1对用4%的多聚甲醛液灌注固定,通过免疫荧光双染观测腰髓组织振荡切片higf1表达特点;其中3对110天龄时用4%的多聚甲醛液灌注固定,通过免疫组织化学法、免疫荧光法观测腰髓组织振荡切片病理变化特征;余3对110天龄时新鲜取材,通过蛋白印迹分析研究gfap、cd11b、sod1、lc3、p62表达特点,通过rt-pcr研究sod1的mrna转录水平。结果:1所有纳入实验的小鼠经dna鉴定,核实为g93a-sod1转基因阳性的雌鼠。2给予g93a-sod1转基因小鼠鞘内注射scaav9-higf1/aav9-gfp,3周时新鲜取材提取蛋白,酶联免疫吸附实验结果显示higf1在神经组织中都有表达,腰段脊髓、胸段脊髓、颈段脊髓、脑干组织中higf1浓度呈递减趋势,腰段脊髓higf1浓度最高,脑干组织中higf1最低;经4%的多聚甲醛液灌注固定的腰髓组织振荡切片免疫荧光双染小显示higf1主要表达在运动神经元。3给予g93a-sod1转基因小鼠鞘内注射scaav9-higf1,改善了小鼠的运动功能,60天龄治疗与对照组中位数相比延迟发病20天、延长生存期44天,90天龄治疗延长生存期38天(p㩳0.01),认为治疗组与对照组相比发病显著推迟、生存期显著延长。4g93a-sod1转基因小鼠表达higf1,110天龄时灌注取材腰髓切片经免疫荧光双染色显示结果显示治疗组的运动神经元丢失较对照组明显少;治疗组星形胶质细胞、小胶质细胞增生较对照组明显少。同期取材的蛋白印迹结果显示治疗组gfap、cd11b蛋白表达水平低于对照组(p㩳0.05)。5g93a-sod1转基因小鼠表达higf1,110天龄时新鲜腰髓取材的蛋白印迹显示治疗组的突变sod1蛋白表达水平低于对照组,治疗组的lc3蛋白表达水平高于对照组,治疗组的p62蛋白表达水平低于对照组,(p值均小于0.05),差异有统计学意义;其脊髓腰彭大部分经超声匀浆用rna试剂盒提取总rna,经rt-pcr反转录,治疗组与对照组的Δct值经统计分析,p㧐0.05,认为组间的sod1的mrna转录水平无差异。第二部分表达higf1对als小鼠模型运动神经元保护作用研究目的:我们给60天龄转基因雌性小鼠鞘内注射scaav9-higf1,研究表达hihg1如何抑制小胶质细胞增生发挥对运动神经元的保护。方法:我们选取美国jackson实验室提供的肌萎缩侧索硬化转基因g93a-sod1小鼠为动物模型,应用其提供的引物序列和鉴定方法对转基因g93a-sod1小鼠进行pcr鉴定,dna鉴定为sod1阳性的转基因g93a-sodl雌性小鼠经同窝配对作为受试对象。60天龄时的g93a-sod1转基因阳性同窝雌性小鼠6对随机分配到药物治疗组鞘内注射scaav9-higf1,对照组鞘内注射aav9-gfp,其中3对110天龄时用4%的多聚甲醛液灌注固定,通过免疫荧光法染色观测tgf-β、arginase、ikbα、ikkγ在腰髓神经组织切片表达分布变化特征;余3对110天龄时新鲜取材,通过蛋白印迹分析研究inos、tnf-α、arginase、tgf-β、cyld、ikbα、ikkβ、ikkγ、pp65表达特点。结果:1g93a-sod1转基因小鼠表达higf1,110天龄时组间的腰髓切片免疫荧光双染色显示治疗组的arginase、tgf-β主要表达在神经元,其荧光强度水平高于对照组,arginase、tgf-β的蛋白印迹灰度比对值经统计学分析,认为治疗组arginase、tgf-β表达水平明显高于对照组(p㩳0.05)。2g93a-sod1转基因小鼠表达higf1,inos、tnf-α的蛋白印达水平明显低于对照组。3g93a-sod1转基因小鼠表达higf1,110天龄时组间的腰髓切片免疫荧光双染色显示ikbα在神经元、小胶质细胞均有表达,治疗组的荧光强度高于对照组;免疫荧光双染色显示ikbγ主要表达在小胶质细胞,治疗组的荧光强度低于对照组。蛋白印迹灰度比对结果经统计学分析显示:治疗组的ikkβ、ikkγ、pp65表达水平明显低于对照组(p㩳0.05);治疗组的cyld、ikbα表达水平明显高于对照组(p㩳0.05)。第三部分鞘内注射scaav9-sgrna-igf1-cas9对als小鼠模型行为学影响及机制研究目的:我们采用crispr-cas9系统,通过给g93a-sod1转基因雌性小鼠鞘内注射scaav9-sgrna-igf1-cas9,观测敲降g93a-sod1转基因雌性小鼠igf1的mrna对其行为学的影响,进一步研究敲降igf1对突变sod1蛋白表达及nf-κb通路上信号分子的影响。方法:我们选取美国jackson实验室提供的肌萎缩侧索硬化转基因g93a-sod1小鼠为动物模型,应用其提供的引物序列和鉴定方法对转基因g93a-sod1小鼠进行pcr鉴定,dna鉴定为sod1阳性的转基因g93a-sodl雌性小鼠经同窝配对作为受试对象。30天龄时的g93a-sod1转基因阳性同窝雌性小鼠7对随机分配到药物治疗组鞘内注射scaav9-sgrna-igf1-cas9,对照组鞘内注射scaav9-sgrna-lacz-cas9,观察行为学变化、发病及生存期。另外选取6对以同样的干预方法进行机制研究,其中3对90天龄时用4%的多聚甲醛液灌注固定,通过免疫组织化学法、免疫荧光法观测ikkβ、pp65在腰髓神经组织切片表达分布变化特征;余3对90天龄时新鲜取材,通过蛋白印迹分析研究sod1、lc3、p62、inos、tnf-α、arginase、migf1、tgf-β、cyld、ikbα、ikkβ、ikkγ、pp65表达特点。结果:1敲降g93a-sod1转基因小鼠igf1,小鼠的体重、评分从70天龄时治疗组较对照组低,同时转轮在80天龄时治疗组较对照组低,显示运动功能损害治疗组发生更早;发病、生存期中位数治疗组与对照组相比:治疗组提前10天发病,提前16天终末,数据经统计分析p㩳0.01,具有极显著差异。2降g93a-sod1转基因小鼠igf1,90天龄小鼠腰髓组织切片免疫组织化学方法染色smi32、gfap、iba-1,结果显示治疗组的运动神经元丢失较对照组明显多,治疗组星形胶质细胞、小胶质细胞增生较对照组明显多。3敲降g93a-sod1转基因小鼠igf1,蛋白印迹结果显示:90天龄治疗组突变sod1蛋白表达水平明显高于对照组(p㩳0.05)。治疗组的lc3-bⅡ蛋白表达水平明显低于对照组(p㩳0.05)。4敲降g93a-sod1转基因小鼠igf1,90天龄时取其新鲜腰髓进行的蛋白印迹实验结果显示:治疗组arginase、tgf-β、migf1的表达水平明显低于对照组(p㩳0.05)。5敲降g93a-sod1转基因小鼠igf1,90天龄时取其新鲜腰髓进行蛋白印迹实验,结果显示治疗组的inos、tnf-α蛋白表达水平明显高于对照组(p㩳0.05)。6敲降g93a-sod1转基因小鼠igf1,90天龄时灌注取材,腰髓膨大部分切片进行ikkβ、pp665免疫荧光双染色,结果显示pp65主要分布在小胶质细胞,治疗组小胶质细胞数较对照组多,治疗组的荧光强度强于对照组。ikkβ在小胶质细胞和非小胶质细胞均有表达;90天龄时取其新鲜腰髓进行蛋白印迹实验结果显示,治疗组的nf-κb信号通路正向调节因子ikkβ、ikkγ、pp65水平明显高于对照组(p㩳0.05),治疗组的nf-κb信号通路负向调节因子cyld、ikbα明显低于对照组(p㩳0.05)。结论:1通过查阅文献资料,综合分析所取得的实验结果,认为突变sod1蛋白、炎性因子inos、tnf-α、nf-κb通路、igf1之间存在这样的关联,即在als小鼠表达higf1促进突变sod1降解,减轻了运动神经元的毒害作用,inos、tnf-α呈现低表达,抑制小胶质细胞增生,下调nf-κb通路信号因子表达,进一步减轻了对运动神经元损伤性作用,临床表现为als小鼠发病延迟、生存期延长。2相反,在als小鼠脊髓敲降igf1使突变sod1降解受阻,其表达累积增加、毒性加剧,加重了对运动神经元的毒害作用,inos、tnf-α呈现高表达,小胶质细胞明显增生,进而上调NF-κB通路信号因子表达,加重对运动神经元产生了损害作用,因而临床表现为提前发病、生存期缩短。3基于以上研究结果我们认为突变SOD1蛋白毒性致使运动神经元发生炎性反应,炎性因子表达上调,刺激小胶质细胞增生活化,炎性级联发生,共同参与了ALS疾病的发生,但其信号介导通路仍有待进一步研究。4通过对ALS小鼠基因治疗表达hIGF1促进了突变SOD1蛋白降解,抑制了以上病理进展从而发挥了治疗效应,属于对因治疗,为临床ALS疾病的治疗提供了实验依据,本实验同时提示抑制炎性反应过程的各个环节都是治疗ALS疾病的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R744.8

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