高乳酸通过线粒体通路损伤星形胶质细胞的实验研究

发布时间：2018-05-19 17:29

  本文选题：脑缺血 + 糖尿病　； 参考：《宁夏医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究目的:使用高乳酸模拟体外糖尿病伴随脑缺血模型,研究其对星形胶质细胞的损伤作用及与线粒体通路的关系,为进一步理解糖尿病加重脑缺血损伤的机制提供新的思路。研究方法:本研究利用体外培养的MA-h小鼠海马趾星形胶质细胞进行试验。待细胞传代至第二代时,为了探讨高乳酸对星形胶质细胞的损伤作用及其机制,将MA-h细胞进行以下分组:(1)对照组:使用DMEM/F12完全培养基,37℃,5%CO2培养。(2)使用含有2.5mM乳酸的DMEM/F12完全培养基,37℃,5%CO2培养。(3)使用含有5mM乳酸的DMEM/F12完全培养基,37℃,5%CO2培养。(4)使用含有10mM乳酸的DMEM/F12完全培养基,37℃,5%CO2培养。(5)使用含有15mM乳酸的DMEM/F12完全培养基,37℃,5%CO2培养。倒置显微镜下观察不同浓度乳酸对星形胶质细胞形态的影响,MTT法检测细胞生存率;DHE荧光探针检测ROS的含量;TMRM荧光探针检测线粒体膜电位情况;Western Blot及免疫细胞荧光检测MA-h细胞胞浆与胞核中凋亡相关因子caspase-3,线粒体通路相关因子caspase-9,AIF、CytC以及总PKA和磷酸化的PKA在不同处理组中的表达情况。研究结果:(1)倒置显微镜下观察细胞形态,与对照组相比较,2.5mM乳酸干预后星形胶质细胞密度减少,胞体大小不一,突起变小变短,细胞间的连接减少,随着乳酸浓度的增加,细胞密度进一步减少,部分细胞由贴壁状态转为悬浮状态,死亡细胞和细胞碎片增多。(2)MTT实验结果显示:使用2.5mM的乳酸干预后,星形胶质细胞的存活率由对照组的(0.35±0.02)降低至(0.25±0.05),随着乳酸浓度的增加,细胞存活率持续下降,干预乳酸浓度为15m M时,存活率仅为(0.18±0.03)。(3)DHE荧光探针检测ROS实验发现:各组别的荧光强度在600nm紫外光激发下达到最强,相同波长的紫外光激发下,2.5mM乳酸干预组的荧光强度明显高于对照组(P0.05),5mM乳酸干预组的荧光强度高于2.5m M乳酸干预组(P0.05)。(4)TMRM荧光探针实验发现:各组别的荧光强度在580nm紫外光激发下达到最强,相同波长的紫外光激发下,2.5mM乳酸干预组的荧光强度明显高于对照组(P0.05)。(3)Western Blot及免疫细胞荧光实验显示:高乳酸干预组星形胶质细胞胞浆中中凋亡相关因子caspase3、线粒体通路相关因子AIF、CytC、caspase-9的表达均明显高于对照组(P0.05),且乳酸浓度越高,增加效果越明显,而胞核中AIF的表达无明显差异(P0.05);乳酸干预组T-PKA的表达高于对照组(P0.05),5mM乳酸能使胞浆中PKA的磷酸化水平显著升高(P0.05),而胞核中PKA的磷酸化水平随着干预乳酸浓度的增加而不断降低。结论:(1)高乳酸能造成星形胶质细胞的损伤,存活率下降,乳酸浓度越高,损伤作用越明显.(2)线粒体膜电位下降,ROS产生增加参与了高乳酸对星形胶质细胞的损伤。(3)高乳酸通过线粒体通路损伤星形胶质细胞
[Abstract]:Objective: to study the effects of high lactate on astrocyte injury and mitochondrial pathway in order to provide a new idea for further understanding the mechanism of diabetes mellitus exacerbating cerebral ischemia. Methods: MA-h mouse hippocampal astrocytes were cultured in vitro. In order to investigate the damage effect of high lactic acid on astrocytes and its mechanism, MA-h cells were divided into the following groups: control group: DMEM/F12 complete culture medium (37 鈩，

本文编号：1911006