肢体缺血后处理改善大鼠慢性脑缺血对Akt信号通路和自噬及LIONG-1的影响

发布时间：2018-05-21 09:01

本文选题：慢性脑缺血 + FeCl_3　；参考：《济南大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的慢性脑缺血(chronic cerebral ischemia,CCI)是指由于各类致病因素引起的长期脑组织血供受阻(低于40~60ml/100g/min)而引起的疾病,是临床的常见病、多发病,在临床上可见病人持续性或进行性学习记忆能力下降,是导致血管性痴呆、Bins wanger病、老年性痴呆等多种临床常见脑血管病的根本因素。目前随着社会老龄化,临床发病率逐年增加,CCI已成为医学界研究的重点课题之一。本研究通过建立最佳浓度的三氯化铁CCI模型,研究CCI发生发展过程中大鼠脑组织中AKT信号通路和LINGO-1及自噬的变化,探讨其可能的机制,并通过肢体缺血后处理的干预作用来观察对脑组织的改善作用,旨在完善CCI的病理生理及调控机制和治疗方法,为CCI的治疗寻找新的治疗靶点。实验过程1.CCI动物模型的模型按体重均衡原则将120只SPF级Wistar大鼠随机分为假手术组、颈总动脉结扎组、FeCl_3 20%组、35%组、50%组和70%组,每组20只,雌雄各半。结扎组大鼠采用结扎双侧颈总动脉(permanent occlusion of bilateral common carotid arteries,BCCA)法建立CCI模型,FeCl_3组大鼠采用不同浓度FeCl_3溶液诱导BCCA形成血栓方法建立CCI模型。观察各组动物的死亡率、神经行为学评分、学习记忆能力、血栓重量以及颈总动脉和脑组织的病理学改变,从而筛选出最佳浓度的三氯化铁CCI动物模型。2.肢体缺血后处理对CCI大鼠脑组织中AKT信号通路和LINGO-1及自噬的影响按照体重均衡原则将70只SPF级Wistar大鼠随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=30)和治疗组(n=30),雌雄各半。采用50%FeCl_3诱导大鼠BCCA形成血栓法建立CCI动物模型。模型组大鼠根据造模后饲养时间的不同分为1wk、2wk、3wk组,每组10只。治疗组根据造模后肢体缺血后处理时间的不同分为1wk、2wk、3wk组,每组10只。造模组大鼠每天双后肢加压,早晚各一次;假手术组大鼠建模时使用0.9%的生理盐水代替Fe Cl_3溶液。各组大鼠分别通过Y迷宫测试评估学习记忆能力;HE染色法观察各组大鼠脑组织病理改变;免疫组织化学法(immunohistochemical,IHC)检测和Western blotting(WB)脑组织中Akt、p-Akt 308、LINGO-1、LC3-B和Beclin-1的蛋白表达变化;荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative RCR,RT-qPCR)法检测脑组织中AktmRNA、LC3-BmRNA、Beclin-1mRNA和LINGO-1m RNA的表达。另取70只大鼠(分组、手术同上)仅用吸有50%Fe Cl_3溶液(假手术组为生理盐水)的小滤纸片环形贴敷左侧颈总动脉,右侧颈总动脉不做处理。肢体缺血后处理结束后,用MP100-16导生理信号采集分析系统检测血压、脑血流量和血管阻力。实验结果1.不同浓度FeCl_3法建立CCI模型的比较(1)20%、35%和50%FeCl_3组大鼠死亡率(5%,15%,10%)与结扎组(45%)相比均显著降低(c2=8.533,P=0.003;c2=4.286,P=0.038;c2=6.144,P=0.013)。(2)结扎组和FeCl_3组神经功能评分与假手术组相比无显著差异(P0.05)。(3)不同浓度的FeCl_3对颈总动脉和脑组织的病理和检查结果显示35%和50%FeCl_3均能形成较好的血栓型动脉腔狭窄模型,且50%FeCl_3引起大鼠动脉腔狭窄程度和脑组织损伤严重于35%FeCl_3。(4)35%FeCl_3组和50%FeCl_3组大鼠Y迷宫正确反应次数与结扎组相无显著差异(P0.05)。(5)20%FeCl_3组大鼠血栓重量较35%FeCl_3组和50%Fe Cl_3组显著降低(P0.01),50%FeCl_3组和35%FeCl_3组无显著差异(P0.05)。综合上述结果,选用50%的FeCl_3建立CCI模型。2.FeCl_3法建立CCI模型大鼠的学习记忆能力、脑血流量和组织病理学改变及肢体缺血后处理的干预作用(1)Y迷宫结果表明,分别与模型1wk、2wk、3wk组相比,治疗1wk、2wk、3wk组大鼠学习能力均显著增加(P0.05),且模型组和治疗组均表现为增加趋势。(2)血流检测结果表明,堵塞一侧颈总动脉后,分别与模型1wk、2wk、3wk组相比,治疗1wk、2wk、3wk组大鼠脑血流量均显著增加(P0.05),脑血管阻力均显著降低(P0.05),且模型组和治疗组脑血流量均表现为增加趋势,脑血管阻力均表现为降低趋势,但血压均无显著性差异(P0.05)。(3)HE染色结果显示,假手术组大鼠脑组织结构正常。模型组不同时相脑组织均有不同程度损伤,且成增加趋势。治疗组大鼠脑组织损伤明显改善。3.肢体缺血后处理对CCI大鼠脑组织中AKT信号通路和LINGO-1及自噬的影响。(1)WB实验结果表明,与假手术相比较,模型1wk、2wk、3wk组大鼠脑组织中p-Akt 308、LC3-B和Beclin-1蛋白表达均显著升高(P0.05),且逐渐增加;LIONG-1蛋白表达亦显著性增加(P0.05)。分别与模型1wk、2wk、3wk组比较,治疗1wk、2wk、3wk组大鼠脑组织中p-Akt 308、LC3-B和Beclin-1蛋白表达量均显著升高(P0.05);LIONG-1蛋白表达量均显著降低(P0.01),且随治疗时间的延长逐渐降低;Akt在各组中无明显变化。(2)免疫组织化学法结果显示,p-Akt 308、LC3-B、Beclin-1和LIONG-1在假手术组大鼠脑组织中几乎没有表达,在模型组不同时间点大鼠脑组织病变区域表达明显增加;治疗组大鼠脑组织中p-Akt 308、LC3-B、Beclin-1表达增加,LINGO-1表达减少。(3)RT-qPCR法结果表明,与假手术组比较,模型1w、2w、3w组大鼠脑组织中Aktm RNA、LC3-Bm RNA、Beclin-1mRNA和LIONG-1mRNA的表达均显著升高(P0.05)。分别与模型1w、2w、3w组比较,治疗1w、2w、3w组大鼠脑组织中Akt mRNA、LC3-BmRNA、Beclin-1mRNA的表达量均显著增加(P0.01),且逐渐增加;LIONG-1m RNA的表达量均显著降低,且随治疗时间的延长逐渐降低。结论1.FeCl_3法建立CCI动物模型与结扎法效果相同并能提高模型成功率,且制备模型稳定可靠其中50%FeCl_3引起大鼠颈总动脉腔狭窄和脑组织损伤严重程度最佳,故选用50%FeCl_3建立CCI模型。2.LIP可提高CCI大鼠学习记忆能力。3.LIP可进一步提高对侧颈总动脉血流量,减小脑血管阻力。4.LIP可改善CCI所致大鼠脑组织病理学改变。5.LIP可通过降低LINGO-1含量、进一步激活Akt信号通路和自噬来保护CCI引起的脑组织损伤。
[Abstract]:Objective : To establish a CCI model of CCI in rats with chronic cerebral ischemia ( CCI ) . The expression of AktmRNA , LC3 - BmRNA , Beclin - 1 , LC3 - B and Beclin - 1 in brain tissue were detected by HE staining . ( 2 ) The results of blood flow examination showed that the cerebral blood flow in the brain tissue of rats treated with sham operation was significantly increased ( P0.05 ) . The results showed that the expression of p - A304 , LC3 - B and Beclin - 1 in brain tissue of rats with sham operation group increased significantly ( P0.05 ) . The results showed that the expression of the mRNA , LC3 - BmRNA , Beclin - 1 mRNA and LIONG - 1 mRNA in the brain tissues of rats with sham - operated group increased significantly ( P0.01 ) . The results showed that the expression of the mRNA , LC3 - Bm RNA , Beclin - 1 mRNA and LIONG - 1 mRNA in brain tissue of rats with 1 w , 2w , 3w group were significantly increased ( P0.01 ) .
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

【参考文献】