BAG-1L过表达对缺氧神经细胞保护作用机制的研究

发布时间：2018-05-24 18:00

本文选题：BAG-1L基因 + 神经细胞　；参考：《青岛大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的探讨重组慢病毒介导的BCL-2结合抗凋亡基因(BCL-2 associated athanogene-1,BAG-1)过表达对缺氧诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用,并研究其与热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的相互作用以及对磷酸肌醇-3/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法构建表达外源性BAG-1L基因的重组慢病毒,感染体外培养对数生长期的SH-SY5Y细胞,感染48 h后采用蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测靶细胞中BAG-1L蛋白的表达。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达BAG-1L基因的SH-SY5Y细胞作为实验组,即重组慢病毒感染组(感染携带BAG-1L基因和荧光蛋白基因的慢病毒),同时设置载体对照组(感染携带荧光蛋白基因但不携带BAG-1L基因的慢病毒)和细胞对照组(未感染慢病毒)。对3组细胞分别进行缺氧4 h,8 h,16 h,24 h再复氧24 h处理,采用细胞增殖与活性检测试剂盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)检测不同处理条件下细胞活性,选择最佳缺氧时间用于研究。流式细胞仪检测分析缺氧8 h处理后3组细胞凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)检测缺氧8 h处理后BAG-1L,HSP70以及AKT m RNA转录水平;Western Blot技术检测缺氧8 h后BAG-1L,HSP70,AKT,磷酸化AKT(Phosphorylated AKT,p-AKT)蛋白水平。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。结果1.BAG-1L过表达慢病毒载体构建成功,感染SH-SY5Y细胞48 h后重组慢病毒感染组检测到外源性BAG-1L蛋白条带。2.随着缺氧时间延长,3组细胞活性均呈先上升后下降的趋势,8 h达高峰,故选缺氧8 h复氧24 h作为神经细胞缺氧的模型。CCK-8检测结果显示,缺氧8 h处理后重组慢病毒感染组比细胞对照组和载体对照组细胞活性均明显增高(A值:0.689±0.036比0.425±0.013、0.400±0.012,均P㩳0.01)。3.重组慢病毒感染组、细胞对照组和载体对照组缺氧8 h后流式细胞仪检测细胞凋亡情况,细胞凋亡率(%)分别为:26.97±1.82、36.4±1.45和35.77±3.74;重组慢病毒感染组缺氧8 h后细胞凋亡情况明显低于其他2组,差异具有统计学意义(均P㩳0.01)。4.RT-q PCR检测结果显示,重组慢病毒感染组、载体对照组和细胞对照组缺氧8 h后m RNA转录水平分别为BAG-1L m RNA(2-ΔΔCt):559.806±74.079、1.010±0.092和1.003±0.101,统计学分析表明,重组慢病毒感染组细胞活性明显高于其他2组,差异有统计学意义(均P㩳0.01);HSP70 m RNA(2-ΔΔCt):3.987±0.412、1.084±0.090和1.005±0.116,统计学分析表明,重组慢病毒感染组细胞活性明显高于其他2组,差异有统计学意义(均P㩳0.01);AKT m RNA(2-ΔΔCt):0.959±0.286、1.133±0.311和1.142±0.655,统计学分析表明,3组差异无统计学意义(均P㧐0.05)。5.Western Blot检测结果显示,重组慢病毒感染组、载体对照组和细胞对照组缺氧8 h后BAG-1L蛋白表达水平分别为(灰度值):2.405±0.167比0.529±0.141、0.601±0.099,均P㩳0.01;HSP70蛋白表达水平分别为(灰度值):0.997±0.123比0.634±0.091、0.584±0.106,均P㩳0.01,p-AKT蛋白表达水平分别为(灰度值):1.234±0.118比0.661±0.210、0.712±0.199,均P㩳0.05。重组慢病毒感染组均高于细胞对照组和载体对照组,差异有统计学意义(均P㩳0.05)。重组慢病毒感染组AKT蛋白表达高于其他两组,但差异没有统计学意义(灰度值:1.103±0.269比0.646±0.188、0.791±0.326,均P㧐0.05)。结论慢病毒介导的BAG-1L基因过表达可以降低缺氧引起的SH-SY5Y细胞损伤,抑制细胞凋亡;对细胞内HSP70、p-AKT蛋白表达具有显著影响,即BAG-1L过表达可能通过上调HSP70的表达及促进PI3K/AKT通路的激活,进而对缺氧引起的神经细胞损伤具有一定的保护作用;可能从分子水平上为临床上缺血性脑血管病的防治提供科学依据。
[Abstract]:Objective To investigate the protective effects of recombinant lentivirus - mediated bcl - 2 - associated athanogene - 1 ( BAG - 1 ) on hypoxia - induced apoptosis of human neuroblastomas ( SH - SYY ) cells . The expression of BAG - 1L protein was detected by Western Blot . The results showed that the expression levels of BAG - 1L after hypoxia for 8 h were significantly higher than those in other 2 groups ( P ? 0 . 01 ) ; the levels of apoptosis in the recombinant lentivirus group , the control group and the control group were significantly higher than those in other 2 groups ( P ? 0.01 ) .
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743

【参考文献】