RAC抑制STAT3信号通路调控人脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的机制研究

  第一部分STAT3和JAK2在人脑胶质瘤中的表达及意义目的：检测STAT3和JAK2在人脑胶质瘤组织中的表达,分析两者的表达水平与胶质瘤病理分级的相关性。方法：收集2013年5月～2014年4月在山东大学齐鲁医院和聊城市脑科医院神经外科手术切除的胶质瘤组织标本共50例为实验组,其中胶质瘤Ⅰ级5例,Ⅱ级9例,Ⅲ级16例,Ⅳ级20例；按照胶质瘤的病理级别划分为低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组,其中Ⅰ级和Ⅱ级胶质瘤患者为低级别胶质瘤组,Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤患者为高级别胶质瘤组。收集同期因外伤或脑出血开颅手术内减压切除的正常脑组织标本10例为对照组。应用荧光定量PCR方法检测上述标本中STAT3和JAK2 mRNA的表达情况,同时应用western blot方法检测STAT3和JAK2蛋白的表达情况,分析两者表达水平与胶质瘤病理分级的相关性。结果：（1）50例胶质瘤组织中STAT3和：fAK2 mRNA的表达水平较10例正常脑组织标本表达水平显著增高,差异具有统计学意义（P<0.01）；（2）50例胶质瘤组织中STAT3和JAK2蛋白的表达水平较10例正常脑组织标本表达水平显著增高,差异具有统计学意义（P<0.01）；（3）胶质瘤组织中STAT3和JAK2蛋白表达水平与病理分级呈正相关,即在高级别病例组中高表达,在低级别病例组中低表达。结论：STAT3和JAK2在胶质瘤组织中表达显著增高且与病理分级呈正相关,提示两者在胶质瘤的发生、发展过程中发挥了重要的作用。STAT3和JAK2有可能成为预测胶质瘤患者预后的分子标志和胶质瘤治疗的临床标靶。第二部分RAC调控胶质瘤细胞增殖、凋亡以及细胞周期的研究目的：将不同浓度RAC作用于人胶质瘤U373细胞,检测RAC对其增殖、凋亡以及细胞周期的影响,旨在探讨RAC在上述过程中发挥的作用,为下一步相关作用机制的研究奠定基础。方法：（1）应用BrdU细胞增殖实验检测不同浓度RAC（0、10、20、30、40、50μM）作用人胶质瘤U373细胞48h后的各组细胞的存活率；以及50 gM RAC作用人胶质瘤U373细胞后不同时间点（0、6、12、24、36、48 h）细胞的存活率;（2）应用流式细胞术（Annexin V-FITC法）分别检测不同浓度RAC（0、10、30.50 μM）作用人胶质瘤U373细胞24 h后的细胞凋亡情况；以及50 μMRAC作用人胶质瘤U373细胞不同时间点（0、6、12、18 h）细胞的凋亡情况；（3）应用流式细胞仪分别检测不同浓度(0、10、30、50RAC作用人胶质瘤U373细胞24 h后各组肿瘤细胞的细胞周期的变化。结果：（1）BrdU细胞增殖检测试剂盒检测结果表明,10-5RAC浓度梯度分别作用48 h后,人胶质瘤U373细胞的存活率逐渐降低,由原来的98%减少至19%,其中当RAC浓度为50μM时存活率最低,提示U373细胞的存活率随RAC作用浓度的增高而逐渐降低；5RAC作用人胶质瘤U373细胞后,在6、12、24、36、48 h时U373细胞的存活率分别为96%、81%、76%、43%和19%,即人胶质瘤U373细胞存活率随RAC作用时间的延长而逐渐降低；（2） Annexin V-FITC检测结果表明,随着RAC浓度的增加,U373细胞的凋亡数量亦逐渐增多,其中当RAC浓度为50μM时细胞凋亡数量最多；用RAC浓度作用于U373细胞后,随着RAC作用时间的延长,凋亡细胞的数量逐渐增多；（3）流式细胞术结果表明,RAC能够使人胶质瘤U373细胞的细胞周期停滞在G1期,且随着RAC作用浓度的增高,G1期细胞数量逐渐增多,当RAC浓度为50 μM时U373细胞中处于G1期的细胞数量最多。结论：（1）RAC对人胶质瘤U373细胞的增殖有抑制作用,抑制程度存在浓度和时间依赖性。（2）RAC对人胶质瘤U373细胞有诱导凋亡的作用,凋亡细胞的数量存在浓度和时间依赖性。（3）RAC能够使人胶质瘤U373细胞的生长停滞在G1期,G1期细胞数量存在浓度依赖性。第三部分RAC抑制胶质瘤细胞增殖的作用机制研究目的：通过对RAC与JAK2-STAT3信号通路之间的作用机制进行研究,以期了解RAC抑制胶质瘤细胞增殖、诱导凋亡的可能作用机制,为RAC临床抗肿瘤应用提供更为重要的实验依据。方法：（1）分别用不同浓度（0、10、20、30、40、50μM） RAC作用人胶质瘤U373细胞,于作用3 h后用western blot检测各浓度组细胞中STAT3和p-STAT3的表达情况；分别用不同浓度（20、30、40、50、100 μM） AG490（JAK2特异性拮抗剂）作用U373细胞,于作用3 h后用western blot检测各浓度组细胞中STAT3和p-STAT3的表达情况；用50μM RAC作用U373细胞,用western blot分别于不同时间点（10、30、60、90、120、150 min和180min）检测细胞中STAT3和p-STAT3的表达情况；（2）用IL-6作用于人胶质瘤U373细胞,用western blot分别于不同时间点（0、10、20、30、40、50、60 min）检测细胞中p-JAK2蛋白的表达情况；预先用50 μM RAC作用U373细胞,接着再用IL-6作用细胞,用western blot分别于不同时间点（0、30、60、90、120、180、340 min）检测细胞中p-JAK2蛋白的表达情况；（3）分别用不同浓度（0、30、40、50 μM） RAC作用人胶质瘤U373细胞,24h后用western blot检测各组细胞中Bax、Bak、cyclin D1、Bcl-2、BclxL、 survivin、Mcl-1和VEGF蛋白的表达。结果：（1）随着RAC浓度的增加,人胶质瘤U373细胞中p-STAT3蛋白的表达量逐渐降,而STAT3蛋白的含量则无显著变化；随着AG490浓度的增加,U373细胞中p-STAT3蛋白的表达量逐渐降低,而STAT3蛋白的含量则无显著变化；用50 μM RAC作用U373细胞,随着时间的延长,细胞中p-STA T3的含量逐渐降低,而STAT3的表达则无明显变化；（2）用IL-6作用于U373细胞,随着时间的延长,细胞中p-JAK2蛋白的表达量逐渐增高,而JAK蛋白的表达则无显著变化；预先用50μM RAC作用U373细胞,接着再用IL-6作用细胞,随着作用时间的延长,细胞中p-JAK2蛋白的表达量逐渐降低,而JAK蛋白的含量则无显著变化；（3）RAC作用U373细胞后,Bak和Bax蛋白的表达量随RAC浓度的增高而逐渐增高；survivin、Bcl-2、Bcl-xL、cyclin D1、VEGF、Mcl-1蛋白的表达均随RAC浓度的增高而逐渐降低结论：RAC可能是通过抑制JAK2/STAT3信号传导通路,进而上调促凋亡基因的表达和抑制抗凋亡基因的表达,达到抑制人胶质瘤U373细胞的增殖和促凋亡作用。

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015

 

文章目录

中文摘要

英文摘要

符号说明

第一章 研究背景

第二章 STAT3和JAK2在人脑胶质瘤中的表达及意义

    2.1 前言

    2.2 对象与方法

    2.3 结果

    2.4 讨论

    2.5 结论

第三章 RAC调控胶质瘤细胞增殖、凋亡以及细胞周期的研究

    3.1 前言

    3.2 研究对象与方法

    3.3 结果

    3.4 讨论

    3.5 结论

第四章 RAC抑制胶质瘤细胞增殖的作用机制研究

    4.1 前言

    4.2 研究对象与方法

    4.3 结果

    4.4 讨论

    4.5 结论

参考文献

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