P2X7受体介导NLRP3炎症小体活化在大鼠脑出血后脑损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2018-06-02 23:06

本文选题：脑出血P2X7R + NLRP3炎症小体　；参考：《南方医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景：脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是脑卒中最严重的类型,有着高发病率和高死亡率。然而,由于我们对脑出血后脑损伤机制的认识不足,目前临床上缺乏满意的药物治疗手段。因此,为了探索有效的治疗方法,我们急需阐明本疾病的病理生理机制。目前,越来越多的研究表明固有免疫及炎症反应参与脑出血后继发性脑损伤。最近,有研究报道细胞内Nod样受体(Nod like receptors)在固有免疫及炎症反应的进程中扮演着重要角色。NLRP3 (NLR family, pyrin domain-containing 3,又名cryopyrin),是一种多蛋白复合体,是目前研究最透彻的Nod样受体家族成员,它包括衔接蛋白ASC (apoptosis-associated speckrlike protein containing a CARD)及其效应蛋白caspase-1。Caspase-1一旦被激活,可裂解IL (interleukin)-1β和IL-18前体,产生成熟且活化形式的IL.1β和IL.18,从而导致其他如中性粒细胞等免疫细胞的募集和激活。多项研究表明,NLRP3炎症小体在脑出血及其他中枢神经系统疾病的进程中扮演着至关重要的作用,而与该炎症小体激活有关的具体机制仍备受争论。P2X7R(purinergic 2X7 receptor)是一种ATP门控的跨膜离子通道受体,由于作为NLRP3炎症小体激活的关键调节因子并参与其炎症级联反应而备受关注。越来越多的研究表明,P2X7R在中枢神经系统疾病的病理生理过程中发挥重要作用,如缺血性卒中、蛛网膜下腔出血、创伤性脑损伤、急性脊髓损伤、癫痫、神经性疼痛以及神经退行性疾病。然而,P2X7R在脑出血中的作用尚未见报道,而且P2X7R与NLRP3炎症小体在脑出血后脑损伤过程中的相互作用也尚不明了。研究表明,脑出血后NADPH氧化酶2 (NADPH oxidase 2, NOX2)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)激活并促进脑损伤进程,因为它们的基因敲除小鼠在脑出血后的脑水肿和细胞死亡均较野生型小鼠减少。在激活的小胶质细胞中NOX和iNOS可分别产生超氧阴离子(O2-)和一氧化氮(NO),而它们是中枢神经系统疾病中极具破坏性的促炎因子。更为重要的是,一氧化氮和超氧阴离子可自发性地反应并生成一种更强大的氧化活性物质--过氧化亚硝酸盐(ONOO-)。据报道,ONOO-参与缺血性卒中、创伤性脑损伤、急性脊髓损伤及神经退行性疾病的病理过程。本课题组已经证明,在注射血红蛋白造成的大鼠脑出血模型中,血肿周围脑组织产生了大量的ONOO-。然而,ONOO-在脑出血后脑损伤中的具体作用机制尚未完全阐明。ONOO-除了拥有氧化或硝化蛋白质、脂质和DNA的能力以外,还能通过激活一些生物信号通路以参与神经炎症及IL-1β的产生,并导致破坏性病理结局。然而,在脑出血中ONOO-的产生与IL-1p的分泌之间的具体联系尚不清楚。在许多体内外疾病模型中,P2X7R被证明是NOX2激活信号通路中的上游分子。近期研究表明,在缺血性卒中中,NOX2介导的氧化应激可激活NLRP3炎症小体从而导致神经血管损伤。值得注意的是,Hewinson等将内毒素加入培养的人类单核细胞中,P2X7R依赖的NOX激活及ONOO-合成在caspase-1活化及IL-1β成熟化的进程中起着至关重要的作用。在脂多糖诱导的大鼠纹状体炎症损伤模型中,小胶质细胞中的P2X7R激活,使iNOS及3-nityrosine(3-NT, ONOO-的标志物)产生增加,而且这一过程可以被P2X7R抑制剂oxATP (oxidized ATP)所阻断。尽管如此,目前P2X7R、NLRP3炎症小体以及NOX2/iNOS依赖的ONOO-产生在脑出血后脑损伤中的作用及其相互之间的联系仍有待阐明。因此,我们提出假设：在脑出血后,P2X7R激活,并活化NOX2产生的超氧阴离子和iNOS产生的一氧化氮反应生成ONOO-,后者激活NLPR3炎症小体,介导IL-1p和IL-18的成熟和分泌,引起一系列炎症反应,从而加重脑损伤。目的：本研究通过建立胶原酶注射大鼠脑出血模型：1、检测不同时间点脑组织中P2X7R、NLRP3、 ASC及caspase-1的表达变化,并检测P2X7R的细胞定位；2、在基因层面针对P2X7R予以干预,了解P2X7R/NLRP3炎症小体信号通路在脑出血后脑损伤中的作用；3、在药物层面针对P2X7R予以干预,为进一步临床研究提供理论基础；4、观察P2X7R对NOX2和iNOS及ONOO-表达的影响,并通过干预剂清除ONOO-,以观察P2X7R, NLRP3炎症小体及其组件的表达变化,进一步阐明NLRP3炎症小体的激活机制。研究方法：1、实验设计与分组(1)36只大鼠随机分为6组：假手术组,脑出血后6h、12h、24h、48h及72h组。应用免疫印迹(Western blot)方法检测P2X7R、NLRP3、ASC及caspase-1的表达情况,应用免疫荧光(immunofluorescence)技术观察P2X7R的细胞定位情况。(2)88只大鼠随机分为4组：假手术组、生理盐水对照组、空白siRNA (control siRNA)对照组及P2X7R siRNA组。通过Western blot和实时荧光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)方法检测P2X7R siRNA的干扰效率,干湿重法测量脑组织水含量变化及改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score, mNSS)评估大鼠神经功能。(3)132只大鼠随机分为4组：假手术组、生理盐水对照组、BBG (Blue Brilliant G)50mg/kg组及BBG 100mg/kg组。采用干湿重法及苏木素伊红染色(Hematoxylin Eosin staining)测检测脑水肿变化,]mNSS法评估大鼠神经功能,TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)检测神经元凋亡,Western Blot及RT-PCR检测相应的蛋白分子变化,IF检测中性粒细胞浸润及NOX2和iNOS及ONOO"表达情况。(4)33只大鼠随机分为3组：假手术组、生理盐水对照组和FeTPPS组。Western Blot检测相应的蛋白分子变化。2、脑出血模型制作成年雄性SD大鼠,体重为280-320g,在立体定向仪辅助下,向大鼠右侧尾状核注射胶原酶-Ⅶ (1μl,0.25 U),制成大鼠脑出血模型。假手术组大鼠以同样的方法在相同位置仅做单纯穿刺。3 RT-PCR方法检测]nRNA表达水平大鼠深度麻醉,断头取脑。取患侧损伤脑组织约40mg,负80℃冰箱保存备用。采用GeneJETTM RNA Purification Kit试剂盒按说明书步骤提取RNA。逆转录后采用ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪进行实时PCR。4、Western Blot检测蛋白表达变化大鼠深度麻醉,断头取脑,取患侧损伤脑组织约100mg,-80℃冰箱中保存备用。组织标本经匀浆、裂解、离心后,采用Bradford法蛋白定量。蛋白裂解液依次经过电泳、转膜、孵育一抗及二抗、显影及定影。凝胶成像系统扫描并分析目的蛋白表达变化。5、组织石蜡切片的制作大鼠麻醉后,先后用生理盐水和4%多聚甲醛心脏灌注。冠状切面切取损伤处脑组织,置于4%多聚甲醛,4℃条件下固定24小时。组织脱水、透明后,制作成石蜡切片,切片厚度3μm。捞片、风干、烤片后置于负20-C冰箱备用。6、组织学染色及血肿体积计算切取损伤处脑组织(厚度1mm)包埋、切片后进行苏木素伊红染色。Image Pro Plus 6.0软件计算血肿体积。7、免疫荧光染色石蜡切片脱蜡至水,在Tris-EDTA (PH 8.5)或柠檬酸盐中给予微波热修复21分钟；血清封闭后滴加一抗,4℃孵育过夜,PBS溶液冲洗后滴加相应荧光二抗,室温下孵育1h。对于荧光双标,一抗分别依次在4℃孵育过夜；显微镜下观察、拍照并分析。8、TUNEL染色按说明书步骤进行原位凋亡检测试剂盒进行TUNEL染色,对于TUNEL与NeuN共染者,先通过免疫荧光法进行NeuN染色,再进行TUNEL染色。9、脑组织水含量检测分别在造模后24或72小时麻醉大鼠、断头取脑,将脑切成左右两侧大脑及小脑三部分,去除脑干和嗅束,称取湿重。小脑作为参照。将脑组织放入烤箱中烘烤(100℃,持续24h),称取干重。脑组织含水量(%)=[(湿重一干重)/湿重]×100%。10、行为学检测采用改良神经功能缺损程度评分方法(mNSS)在造模后24或72小时分别对其进行评分。11、统计学分析采用SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)软件进行统计学分析,数据用均数±标准差(mean±SD)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。实验结果：1、脑出血后P2X7R增加且主要表达在小胶质细胞通过检测脑出血后不同时间点蛋白的表达量以研究P2X7R对胶原酶引起的脑出血是否有反应。Western Blot结果显示P2X7R蛋白水平在脑出血后6小时就明显增加(P 0.05 vs. Sham),并在24小时(P0.01 vs. Sham)达到高峰,随后,P2X7R蛋白水平下降,于72小时回到基线(假手术组)水平。通过免疫荧光双标实验进一步探究P2X7R的细胞定位,结果表明P2X7R主要表达在小胶质细胞,而不在星形胶质细胞或神经元表达。2、脑出血后NLRP3, ASC, caspase-1表达上调NLRP3被证明是P2X7R的下游信号分子,于是我们通过Western Blot方法检测了NLRP3炎症小体组分的表达变化。NLRP3.ASC.caspase-1水平在脑出血后6小时开始升高(P0.05 vs.Sham),于24小时达到高峰(P0.01 vs.Sham),随后逐渐下降,但仍高于假手术组水平(P0.05 vs.Sham).3、P2X7R干扰RNA可减轻脑出血后脑组织水含量、改善神经功能缺损我们接下来探究P2X7R是否参与了脑出血后的脑损伤进程,在脑出血模型制作24小时前,我们对大鼠注射了两条P2X7R siRNA混合物。RT-PCR结果表明,P2X7R siRNA有显著的干扰效果(p0.01)。Western Blot结果显示,与生理盐水对照组和Control siRNA对照组相比,脑出血后24小时P2X7R siRNA组的P2X7R蛋白水平分别减少了41.3%和40.7%(both P0.05)；生理盐水对照组(82.56± 0.72%　vs.Sham,79.40±0.44%,P0.01)和Control siRNA对照组(82.44±0.75 % vs.Sham,79.40±0.44%,P0.01)的患侧脑组织水含量较假手术组明显增加,而P2X7R siRNA组(P0.05 vs.Vehicle or Scramble siRNA)较生理盐水对照组和Control siRNA对照组则明显减少。与此同时,P2X7R干扰RNA显著缓解了脑出血后24h(8.66±1.15 vs.Vehicle,10.00±1.95,P0.05；vs.Scramble siRNA,10.50±1.26,P0.05)和72h的大鼠神经功能缺损。4.P2X7R siRNA抑制‘NLRP3炎症小体激活及IL-1β、IL-18的释放NLRP3炎症小体在脑出血后脑损伤中起着重要作用,于是,我们进一步研究P2X7R对NLRP3/ASC/caspase-1的激活及IL-1β、IL-18的释放有何影响。首先,P2X7R siRNA显著减少了大鼠脑出血后NLRP3的mRNA表达量(P0.01)。脑出血后生理盐水对照组和Control siRNA对照组NLRP3炎症小体及IL1β、IL-18表达量明显增加(P0.01),而P2X7R干扰RNA可显著抑制炎症小体的激活和IL1β、 IL-18释放(both P0.05)。5、BBG可缓解脑出血后神经功能缺损、脑组织水含量及神经元凋亡我们接下来探究了P2X7R选择性抑制剂BBG的神经作用。结果表明,两个浓度(50 and 100 mg/kg)的BBG对脑出血后24小时(50 mg/kg,81.76±0.32%VS. Vehicle,82.54±0.66%,P0.05:100 mg/kg,81.67±0.43%vs.Vehicle,82.54±0.66%, P0.05)和72小时(50 mg/kg,81.59 ± 1.15%vs. Vehicle,82.94 ± 1.00%, P 0.05; 100 mg/kg,81.74 ± 1.12% vs. Vehicle,82.94 ± 1.00%, P0.05)的脑组织水含量均有明显改善。脑出血后24小时对照组和BBG组的血肿体积分别是91.17±23.54和82.77±21.31(P0.05),差异没有统计学意义,表明BBG并不影响出血量；然而,BBG组(37.79±15.56)的血肿体积在72小时明显较对照组(73.03±19.34)减少,表明BBG能促进脑损伤后的组织重建。同时,BBG能明显缓解脑出血后24小时(50 mg/kg,8.83 ± 1.64 vs. Vehicle,10.00 ± 1.95, P 0.05; 100 mg/kg,8.66 ± 1.55 vs. Vehicle,10.00 ± 1.95, P 0.05)和72小时(50 mg/kg, 6.40 ± 1.64 vs. Vehicle,8.10 ± 1.96, P 0.05; 100 mg/kg,7.00 ± 1.78 vs. Vehicle, 8.10 ±1.96, P0.05)的病变周围组织损伤且改善神经功能缺损。但是,不论是脑组织水含量抑或神经功能缺损,50mg/Kg和100mg/Kg的BBG组均无明显区别,因此接下来的研究均采用50mg/Kg的浓度。与假手术组相比,对照组神经元凋亡明显增加p0.01),而BBG能减少神经元凋亡(P0.01)。6、BBG减少脑出血后P2X7R表达,抑制NLRP3/ASC/caspase-1激活及IL-1β、IL-18分泌脑出血后24小时,BBG显著减少NLRP3的mRNA表达水平(P 0.05 vs. Vehicle),减少P2X7R(P 0.05 vs. Vehicle)、NLRP3(P 0.05 vs. Vehicle)、 ASC(P 0.01 vs. Vehicle)及Caspase-1 (P 0.05 vs. Vehicle)的蛋白表达水平,且减少成熟IL-1β(P 0.05 vs. Vehicle)、IL-18 (P 0.05 vs. Vehicle)的释放。7、BBG减少脑出血后中性粒细胞浸润为了探究P2X7R/NLRP3信号轴对中性粒细胞浸润的影响,我们用Western blot和免疫荧光的方法检测了MPO (Myeloperoxidase,中性粒细胞标记物)的表达情况,结果显示,脑出血后24小时,对照组MPO明显增加(P0.01 vs. Sham),而BBG能明显减少MPO表达(P 0.05 vs. Vehicle)。8、BBG减少脑出血后iNOS表达在大鼠全血和胶原酶脑出血模型中,iNOS表达均增加。于是我们通过Western Blot和免疫荧光的方法来检测脑出血后P2X7R对iNOS表达的影响。结果表明,假手术组中iNOS表达微弱而在脑出血24小时迅速增加(P0.01 vs. Sham),免疫荧光双标显示iNOS主要表达在iba-1阳性的小胶质细胞上,而P2X7R抑制剂BBG能显著减少iNOS的表达(P0.05 vs. Vehicle).9、BBG减少脑出血后NOX2表达NOX2作为超氧阴离子的主要来源,参与了脑出血后脑损伤的病理进程。于是我们进一步通过Western Blot和免疫荧光的方法来检测NOX2的细胞膜亚基gp91phox的表达情况。免疫荧光双标显示gp91phox主要表达在激活的小胶质细胞并且大多与iNOS重合,表明NOX2与iNOS存在的密切的关系。与iNOS部分的结果一致,假手术组中gp91phox表达微弱而在脑出血.24小时迅速增加(P0.01 vs. Sham),而BBG能显著减少其的表达(P0.05 vs. Vehicle).10、BBG减少脑出血后ONOO"产生脑出血后iNOS和NOX2的表达增加促使我们进一步探究P2X7R对ONOO-形成的作用。免疫荧光双标显示3-NT主要表达在激活的小胶质细胞上,且几乎全部与gp91phox重合,表明ONOO-的产生是来源于NOX2,然而,BBG明显减少了3-NT的表达(P0.05 vs. Vehicle).11、过氧化亚硝酸盐清除FeTPPS抑制NLRP3/ASC/caspase-1激活及IL-1β、IL-18产生我们的结果表明小胶质细胞的P2X7R对介导NOX2和iNOS依赖的ONOO-生成有重要作用,这促使我们探究ONOO-是否在P2X7R与NLRP3炎症小体的激活之间起着关键的桥梁作用。为了解决这个问题,我们对大鼠注射了ONOO-清除齐FeTPPS。Western Blot结果显示,FeTPPS显著减少了3-NT的表达(P0.05 vs. Vehicle),并且显著减少了NLRP3 (P0.05 vs. Vehicle)、ASC (P0.05 vs. Vehicle)、caspase-1 (P0.05 vs. Vehicle)的表达及及IL-1β (P 0.05 vs. Vehicle) IL-18(P 0.05 vs. Vehicle)的释放,但是FeTPPS对P2X7R的表达没有影响(P0.05 vs. Vehicle)。综上所述,这些结果表明P2X7R依赖的ONOO-合成可能是NLRP3炎症小体的关键激活剂。结论：脑出血后,P2X7R激活NLRP3炎症小体,促使IL-1β、IL-18释放,促使神经炎症及神经损伤；作为P2X7R下游信号通路的iNOS、NOX2依赖的ONOO-,可能是NLRP3炎症小体激活的启动者。因此,抑制P2X7R或清除ONOO-可能是治疗脑出血后脑损伤的新靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.34

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