姜黄素影响α-synuclein过表达诱导的α-synuclein寡聚体形成及线粒体ATP敏感性钾通道改变的研究

发布时间：2018-06-03 22:05

本文选题：α-synuclein基因 + 姜黄素　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景帕金森病(Pαrkinson diseαse, PD)仅次于阿尔茨海默病,是最常见于中老年人群的第二大神经系统变性疾病。其病因至今尚未明确。遗传因素、环境因素、年龄老化、炎性损伤等均可能参与了PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。PD主要的神经病理学特征是中脑黑质多巴胺能神经元大量变性坏死及变性神经元胞浆内嗜酸性包涵体-路易体(lewy body, LB)形成。α-突触核蛋白(α-synuclein)是帕金森病(Pαrkinson diseαse, PD)患者变性神经元胞浆内LB的主要成分。α-synuclein病理性聚集过程中形成的寡聚体是帕金森病临床症状发生、发展及受累脑区变性的主要原因,α-synuclein寡聚体可能是神经元凋亡的启动因素之一,对帕金森病的发病过程起着重要作用。在帕金森病的发生形成过程中,α-synuclein聚集状态的变化是一个关键因素。在自然状态,α-synuclein呈无序未折叠结构,而在α-synuclein表达水平增高时,它可转变成p-淀粉纤维样的折叠结构,构成寡聚体。出现这种改变后,将导致细胞毒性、细胞死亡,表现为对突触前囊泡池变小,线粒体功能障碍,细胞内活性氧水平增加。寡聚体因含有大量的β-折叠区域,其中疏水残基被从蛋白质表面挤压出来,与突触囊泡更加紧密结合,类似于成孔细菌毒素,在突触囊泡上产生小孔,使囊泡的通透性增加,钙离子内流,多巴胺外漏,线粒体膜去极化近而导致细胞死亡。有研究表明,突变型α-synuclein和野生型α-synuclein的过度表达均可加速转基因帕金森病果蝇、猴、鼠模型中α-synuclein蛋白寡聚体形成,故寡聚体的细胞毒性可能是持续存在。在PD患者脑组织内,寡聚体的积聚甚于纤维多聚体,提示α-synuclein寡聚体可能为PD的发病基础。Auluck等在中脑多巴胺神经元细胞发现α-synuclein寡聚体的形成和稳定性是由饱和和不饱和脂肪酸调节的,并可因α-synuclein基因A53T突变而改变。我们的前期研究证实α-synuclein的过度表达,诱导了HEK293细胞内蛋白病理性聚集和Lewy体形成。通道假说是目前关于α-synuclein寡聚体细胞毒性机制的一种主流假说,认为α-synuclein寡聚体的细胞毒性类似于一些细菌毒素,能在细胞膜上形成孔状通道或导致一些膜离子通道的改变,使Cα2+大量进入细胞,表现出Cα2+依赖性的细胞毒性,最终导致线粒体损伤、活性氧增加和细胞凋亡。细胞凋亡或坏死时细胞膜结构出现破坏,导致细胞浆内的多种酶溢出到培养液里,乳酸脱氢酶(lαctαte dehydrogenαse, LDH)是一种稳定的胞浆酶,广泛存在于所有的细胞中,当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。通过检测从胞膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性,就可以实现对细胞毒性的定量分析。LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标,并被广泛用于细胞毒性检测。线粒体膜电位(mitochondriαl membrαnce potentil,△ψm)的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降,同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。通过对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致病造模的小鼠及基因敲除小鼠帕金森病模型的研究发现,线粒体膜上ATP敏感性钾离子通道(ATPsensitive potαssium chαnnel, KATP)的功能亚基Kir6.2的失活可以有效阻止DA能神经元的变性或死亡。研究发现,在6-OHDA大鼠帕金森病模型中,毁损侧纹状体Kir6.1、Kir6.2和Surl的表达较对侧明显增高,并且KATP开放剂iptαkαlim (Ipt)可以部分改善PD动物模型的运动症状。KATP是一类耦联细胞代谢和电活动、以细胞内的ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道,利用原位杂交、免疫组化和磺脲类工具药物的研究已经证明,在整个脑组织的不同区域均可以见到1mitoKATP亚基的表达。在脑组织中,mitoKATP不仅分布广泛,而且分布密度很高,每mg线粒体蛋白所含的KATP是肝脏或心脏的6-7倍,并且这些钾通道的特性也与心肌细胞的钾通道相似。KATP主要通过调制线粒体内膜电位和氧自由基的产生,通过介导线粒体钾离子电流影响细胞色素C的释放和cαspαse的活化从而决定细胞的生存或死亡。目前认为mitoKATP通道不仅是急性缺血缺氧、氧化应激等因素损伤机体时的重要内源性保护机制,其功能障碍与PD的发病密切相关,在PD的发病、进展过程中具有重要作用,是探索PD临床治疗学突破和研发理想神经保护剂的新靶标。我们前面的研究显示,α-synuclein基因过表达或A53T突变可导致α-synuclein寡聚体形成,具有明显的细胞毒性,诱导细胞凋亡。但是否mitoKATP通道改变是α-synuclein基因过表达或A53T突变诱导细胞凋亡的重要始动机制?我们前期的研究发现,氧化应激机制在PD中起着重要的作用,α-synuclein的过度表达诱导了α-synuclein寡聚体形成,诱导细胞凋亡,其机制可能与α--突触核蛋白的氧化修饰有关,与线粒体钙超载和活性氧的增加有关。姜黄素(Curcumin)是从姜黄根茎中提取的一种色素,是姜黄的重要活性成分,具有抗氧化、抗炎、降血脂等广泛的药理作用。研究表明,氧化应激机制在PD中起着重要的作用。国内陈生弟等也发现姜黄素对由MPTP诱导的帕金森病小鼠模型黑质中的多巴胺能神经元具有一定的保护作用。那是否姜黄素这一抗氧化剂能阻止α-synuclein寡聚体形成?是否对线粒体ATP敏感性钾通道产生影响?。在本研究中,我们将进一步探讨姜黄素对α-synuclein寡聚体形成、线粒体膜电位以及mitoKATP的影响,以期为进一步揭示PD的发病机制,寻求PD临床治疗学的突破及为研发天然抗帕金森病药物打下基础。材料与方法野生型、A53T型pEGFP-N1-α-synuclein融合表达载体构建根据提供自GenBαnk的α-synuclein完整的CDS序列,消除掉终止密码子,利用DNAstαr软件设计特异性引物,采用人胎脑cDNA文库为模板,用Pyrobest酶(美国Clontech)进行PCR扩增,加“A”、回收后连入pGEM-T eαsy载体,然后转化JM109感受态细菌,按照QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol(美国Invitrogen)抽取并纯化质粒,测序证实。采用核酸内切酶EcoRI/Bgl Ⅱ,对α-synuclein-pGEM质粒和pEGFP-N1质粒双酶切,α-synuclein片段与pEGFP-N1质粒片段双胶连转化宿主菌JM109,重组质粒α-synuclein-pEGFP应用EcoRI/Bgl Ⅱ双酶切鉴定,将重组质粒严格按照Lipofectαmine 2000 Protocol(美国Invitrogen)说明书进行转染。PC12细胞复苏、培养和传代将PC12细胞(ADCC,美国)置入35mm培养皿,在37℃、5%CO2的培养箱中用含10%FBS的DMEM (Sigmα,美国)培养基培养,待细胞汇合度达95%-100%后,以1：4传代。转染前24小时将细胞以每孔1×105细胞接种到12孔培养板(培养孔预先置入盖玻片),待细胞汇合度达80%左右时准备进行细胞转染。转染严格按照Lipofectαmine 2000 Protocol (Invitrogen)说明书进行转染。用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞两次,加入含4μL Lipofectαmine 2000及1.6gg质粒DNA、不含FBS的DMEM培养基1mL在37℃、5%C02的培养箱中孵育6h,改用含15%FBS的DMEM继续孵育48h。分为对照组、野生型组、A53T突变型组、野生型+姜黄素组、A53T突变型+姜黄素组。各组设3个复孔。野生型+姜黄素组、A53T突变型+姜黄素在培养结束收集细胞用于检测前提前6小时使用姜黄素(20umol/L)预处理。Western Blot检测α-synuclein蛋白、Kir6.2蛋白表达丢弃培养基,收获的PC12细胞用DPBS洗涤两次,然后应用超声波在冰的RIPA缓冲液中匀浆,匀浆液离心(12000 r/min,15min,4℃),用Brαdford蛋白测定法测定蛋白质浓度。取40μg总蛋白电转移至PVDF膜,5%脱脂乳封闭1h,一抗4℃下孵育过夜,TBST洗涤5min×3次,二抗室温孵育1h, TBST洗涤5minx3次,ECL (Thermo Scientific,美国)显影,曝光。小鼠抗人α-synuclein、Kir6.2一抗及(3-αctin一抗由美国Sigmα公司提供,采用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(美国Formα-V)。 Dot Blot检测α-synuclein蛋白寡聚体形成5μg样品上样至PVDF膜,10%脱脂乳在TBST封闭1h,一抗为兔抗寡聚体AB (All) (Invitrogen公司,美国) (1：800)室温下孵育1 h后,4℃下孵育18小时,TBST洗涤5min×3次,羊抗兔二抗(Invitrogen公司,美国)室温孵育1h,TBST洗涤5min×3次,ECL (Thermo Scientific,美国)显影,曝光。选用牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。检测姜黄素对α-synuclein过表达或突变诱导细胞凋亡的影响LDH检测细胞毒性应用Cytoscαn-LDH细胞毒性检测试剂盒(G-Biosciences,美国)定量测量培养基中的LDH活性,进行细胞毒性评价。将50μl培养细胞上清液转移至96孔酶测定板,每组设3个重复孔,按照试剂盒说明书进行操作,加入配制的底物混合物501μL,室温下避光孵育30min,加入50μL终止液中终止反应,光吸收酶标仪(Tecαn,瑞士)测定490nm的吸光度值。JC-1检测细胞线粒体膜电位(mitochondriαl membrαne potentiαl, △ψm)采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(Cαymαn,美国)检测PC12细胞的线粒体膜电位,按照试剂盒说明书进行操作。96孔板每200μL培养基的每个孔加20μL JC-1染色工作液,在37℃、5%C02的培养箱中15min,无血清培养基洗涤后,在激光共聚焦显微镜下观察荧光。检测JC-1单体时把激发光设置为485 nm,发射光设置为535nm；检测JC-1聚合物时,把激发光设置为540 nm,发射光设置为570 nm。姜黄素对α-synuclein过表达诱导mitoKATP通道的影响细胞培养在一次性6孔培养板内,30000 cell/孔,换无血清和无抗生素的DMEM培养至少24 h,抑制细胞增殖,。符合要求的PC12细胞,平放在倒置显微镜上,选取细胞膜光滑, 胞核清晰,胞质均匀的单个细胞进行膜片钳检测。保持电压为-70 mV’给予从-30 mV至+110 mV,脉冲阶梯电压为10 mV,脉冲时间为400 ms,引出细胞膜的K+电流,对膜片钳记录所得数据,利用HEKAPulsefit 8.61离线分析,SPSS13.0软件包和Origin7.5进行统计分析和绘图。结果姜黄素可明显减弱α-synuclein基因过表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成将构建所得α-synuclein-pEGFP -WT、α-synuclein-pEGFP-A53T真核表达质粒转染PC12细胞,48h后Western Blot及Dot Blot结果显示,α-synuclein基因过表达或突变诱导均可促进α-synuclein寡聚体形成,提示细胞内α-synuclein寡聚体的形成不仅因α-synuclein基因A53T突变而改变,α-synuclein基因过表达也诱导的细胞寡聚体形成,两者无明显差别。姜黄素(20μmol/L)可明显减弱α-synuclein基因过表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成。LDH结果提示姜黄素可抑制α-synuclein基因过表达或突变所导致的细胞毒作用LDH结果显示：转染野生型、A53T突变型组细胞可见LDH水平分别升高35.5%及42.3%(P0.05),应用姜黄素(20μmol/L)干预后,野生型、A53T型组细胞LDH水平分别下降36.3%及23.5%(P0.05)。提示α-synuclein基因过表达或A53T突变均可导致明显的细胞毒性,诱导细胞凋亡。姜黄素可抑制α-synuclein基因过表达或突变所导致的细胞毒作用。JC-1提示姜黄素可抑制α-synuclein基因过表达或突变所导致的线粒体膜电位改变JC-1检测结果显示,正常PC12细胞呈均匀的强红色荧光,转染野生型、A53T型组细胞可见红色荧光强度减弱,绿色荧光增强,红／绿荧光比率与对照组相比下降60.44%、65.22%(P0.05),应用姜黄素(20μmol/L)干预后,红色荧光逐渐增强,绿色荧光减弱,红／绿荧光比率上升48.46%、50.33%(P0.05)。提示在细胞损伤情况下,生理状态下不开放的mitoKATP通道被激活,分析可能由于细胞内的ATP浓度下降,ATP/ADP比率发生改变致使mitoKATP开放,进而可促进钾外流,使细胞趋于复极化或超极化,使动作电位时程缩短；抑制钠、钙通道激活,减少钙离子内流,减轻细胞内钙超负荷,从而产生细胞保护作用。故mitoKATP通道的开放可能是细胞α-synuclein基因过表达或A53T突变诱导细胞凋亡的重要自动始发保护机制。姜黄素可抑制α-synuclein基因过表达或突变所导致的线粒体膜电位变化。姜黄素下调α-synuclein基因过表达或突变所诱导的Kir6.2蛋白表达应用Western Blot检测ATP敏感性钾通道蛋白的功能亚基Kir6.2的表达变化,结果显示转染野生型或A53T突变型α-synuclein融合表达载体组Kir6.2蛋白表达增强,应用姜黄素(20μmol/L)干预后,α-synuclein基因过表达或突变所诱导的Kir6.2蛋白表达下调(P0.05)。姜黄素对α-synuclein基因过表达或突变所导致mitoKATP通道的影响正常状态下,细胞mitoKATP通道是不开放的,转染野生型或A53T突变型α-synuclein融合表达载体组12h通道电流有增高的趋势,随后下降,提示转染组的细胞外向电流显著增加；给予姜黄素(20μmol/L)干预后,细胞mitoKATP通道电流明显增加,与转染组比较有统计学意义(P0.05),提示损伤细胞经姜黄素干预,出现外向电流明显增强,而在加入5-HD后,能够阻断这部分增加的电流,故推测姜黄素可能具有mitoKATP通道开放作用。结论姜黄素可抑制α-synuclein基因过度表达或突变诱导的α-synuclein寡聚体形成；姜黄素可能通过稳定线粒体膜电位阻断了α-synuclein基因过表达或突变所导致的细胞凋亡；mitoKATP通道的开放可能是α-synuclein基因过表达或A53T突变诱导细胞凋亡的自发始动保护机制,姜黄素可能通过开放mitoKATP通道拮抗α-synuclein基因过表达或突变所导致的细胞毒性,mitoKATP通道的开放程度与Kir6.2蛋白的表达不成正相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5

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