HIF-1α在电针预处理诱导脑缺血耐受中的作用及机制研究
发布时间：2018-06-05 16:48
本文选题：HIF-1α + 电针 ； 参考：《第四军医大学》2014年博士论文
【摘要】：随着我国人口老龄化问题的日益严重，缺血性脑中风的发生率日渐增加，但因为溶栓药物的治疗时间窗较窄及其副作用，仅有少部分患者接受溶栓治疗，因而寻求更好的预防治疗手段成为研究热点。大量研究证实，电针预处理可以诱导脑缺血耐受效应，减轻脑缺血损伤，但其脑保护的相关机制尚未得到完整阐明。 低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在缺血后神经细胞凋亡及微循环的重建等方面发挥重要调控作用，HIF-1α及其下游基因产物在脑缺血损伤中的保护作用已被广泛关注，但其在电针预处理脑保护中的作用及上下游调控机制尚不清楚。 本课题应用大鼠大脑中动脉阻闭模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模拟局灶性脑缺血损伤，研究HIF-1α在电针预处理诱导脑缺血保护效应中的作用及其机制，并对HIF-1α与Notch信号通路在脑缺血损伤中的相互作用关系进行探讨，以期阐明电针预处理的脑缺血保护机制，为电针预处理的临床应用提供新的理论依据。 第一部分 观察电针预处理对缺血再灌注前后HIF-1α的影响 目的： 1.研究缺血再灌注损伤对HIF-1α表达的影响。 2.研究电针预处理对缺血再灌注前后HIF-1α表达的影响。 方法： 雄性SD大鼠96只，体重280~320g，，随机分为两组（n=48）：对照组（CON）和电针预处理组（EA），CON组动物仅建立MCAO模型（n=40），EA组动物接受连续5d电针刺激，每次30min，最后一次电针刺激后24h建立MCAO模型（n=40），分别于最后一次电针刺激后24h和缺血再灌注后2h，6h，24h，48h及72h处死大鼠取缺血半暗带脑组织（n=8），Realtime PCR(RT-PCR)检测缺血半暗带中HIF-1α及HO-1mRNA水平，Western Blot检测缺血半暗带中HIF-1α蛋白表达情况，应用免疫荧光双标染色定位观察HIF-1α在脑内细胞分布情况。 结果： 1. RT-PCR检测显示：缺血再灌注前，CON与EA组中HIF-1α及下游靶基因HO-1mRNA水平差异无统计学意义；缺血再灌注后，EA组HIF-1α及HO-1mRNA水平在再灌注后2h，6h及24h均显著高于CON组(P0.05)，再灌注后48h及72h显著低于CON组(P0.05)。 2. Western Blot检测显示：EA组HIF-1α蛋白表达在再灌注后2h较再灌注前显著升高(P0.05，与缺血再灌注前比较)，并于再灌注后48h达到峰值，再灌注后2h，6h，24h及48h，EA组HIF-1α蛋白表达均显著高于CON组(P0.05，与对照组比较)。 3.免疫荧光双标染色显示：HIF-1α阳性信号与神经元标记物NeuN阳性信号存在共定位。缺血再灌注后24h，EA组HIF-1α阳性细胞及NeuN阳性细胞均显著多于CON组(P0.05)，EA组缺血半暗带中HIF-1α/NeuN双标神经元细胞数量也显著多于CON组(P0.05)。 结论： 电针预处理能显著上调缺血再灌注后缺血半暗带中HIF-1α表达，且HIF-1α表达于缺血后神经元细胞之上。 第二部分 观察抑制HIF-1α表达对电针预处理诱导脑缺血保护的影响 目的： 1.研究HIF-1α抑制剂2ME2对电针预处理诱导脑缺血保护的影响。 2.探讨HIF-1α在电针预处理诱导脑缺血保护中的作用机制。 方法： 雄性SD大鼠80只，体重280~320g，随机分为五组（n=16）：假手术组（Sham），对照组(CON)，电针预处理组（EA），HIF-1α抑制剂组（2ME2）和电针预处理+HIF-1α抑制剂组（EA+2ME2）。Sham组动物接受相同的手术操作，但不插入线栓阻闭大脑中动脉；CON组，2ME2组，EA组及EA+2ME2组动物均建立MCAO模型。EA组及EA+2ME2组动物接受连续5d电针刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；2ME2组及EA+2ME2组动物分别于MCAO模型制备前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各组动物处死（n=8），TUNEL染色检测神经元凋亡，Western Blot检测缺血半暗带中Bcl2及Bax蛋白表达情况；缺血再灌注后72h，各组动物（n=8）评估神经功能学评分后行MRI检查，而后处死行TTC染色检测脑梗死容积。 结果： 1.磁共振成像显示：缺血再灌注后72h，Sham组大鼠T1及T2加权图像均无脑梗死区显像，T1加权图像显示脑梗死区效果不佳，EA组T2加权图像中脑水肿程度显著低于CON组（P0.05）。 2.神经功能评分及TTC染色显示：缺血再灌注后72h，与CON组比较，EA组神经功能评分显著改善(P0.05)，而2ME2可以显著降低EA+2ME2组神经功能评分(P0.05)。CON组和2ME2组神经功能评分差异无统计学意义(P㧐0.05)。脑梗死容积染色结果与神经功能评分结果一致。 3. TUNEL染色显示：缺血再灌注后24h，Sham组脑组织切片中未见TUNEL阳性细胞，而CON组和EA+2ME2组脑组织切片中TUNEL阳性细胞显著多于EA组(P0.05)，CON组与2ME2组脑组织切片中TUNEL阳性细胞差异无统计学意义(P㧐0.05)。 4. Western Blot检测显示：缺血再灌注后24h，与EA组比较，CON组及EA+2ME2组中Bcl-2蛋白表达显著降低(P0.05)；而CON组中Bax蛋白表达显著增加(P0.05)。CON组与2ME2组中Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义(P㧐0.05)。 结论： HIF-1α抑制剂2ME2可以拮抗电针预处理诱导的脑缺血保护作用，HIF-1α可能通过抑制缺血后神经元凋亡，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达，参与电针预处理诱导的脑缺血保护作用。 第三部分 研究脑缺血损伤中HIF-1α与Notch信号通路的相互作用关系 目的： 1.研究脑缺血损伤中HIF-1α与Notch信号通路的活化是否一致。 2.探讨HIF-1α在电针预处理脑保护中的活化是否受Notch信号通路调控。 方法： 雄性SD大鼠32只，体重280~320g，随机分为四组（n=8）：对照组(CON)，电针预处理组（EA），电针预处理+γ分泌酶抑制剂MW167组（EA+MW167）和电针预处理+HIF-1α抑制剂2ME2组（EA+2ME2）。四组动物均建立MCAO模型；EA组，EA+MW167组及EA+2ME2组动物接受连续5d电针刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；EA+MW167组动物于MCAO模型制备前30min侧脑室注射MW167（1mM，10μL）；EA+2ME2组动物于MCAO模型制备前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各组动物处死（n=8），免疫荧光双标染色定位观察HIF-1α及NICD在脑内细胞分布情况，Western Blot检测缺血半暗带中HIF-1α及Notch1NICD蛋白表达情况。 结果： 1.免疫荧光双标染色显示：HIF-1α阳性信号与NICD阳性信号存在共定位。缺血再灌注后24h，EA组缺血半暗带中HIF-1α阳性细胞及NICD阳性细胞均显著多于CON组(P0.05)，EA组缺血半暗带中HIF-1α/NICD双标阳性细胞数量也显著多于CON组(P0.05)。 2. Western Blot检测显示：缺血再灌注后24h，与CON组比较，EA组缺血半暗带中HIF-1α及NICD蛋白表达显著增加(P0.05)；γ分泌酶抑制剂MW167阻断Notch通路激活后，EA+MW167组缺血半暗带中HIF-1α及NICD蛋白表达均较EA组显著降低(P0.05)；而HIF-1α抑制剂2ME2仅降低HIF-1α蛋白表达(P0.05，EA+2ME2与EA比较)，对NICD蛋白表达无显著影响(P0.05，EA+2ME2与EA比较)。 结论： 脑缺血损伤后，HIF-1α与Notch信号通路同时活化；电针预处理可能通过激活Notch信号通路，上调HIF-1α表达，产生脑缺血保护作用。
[Abstract]:With the increasing problem of population aging in China, the incidence of ischemic stroke is increasing, but because of the narrower time window and side effects of thrombolytic drugs, only a few patients receive thrombolytic therapy, so the search for better preventive treatment has become a hot point. Cerebral ischemic tolerance can alleviate cerebral ischemia injury, but its mechanism of brain protection has not been fully elucidated.
Hypoxia inducible factor 1 alpha (hypoxia-inducible factor-1 alpha, HIF-1 a) plays an important role in the regulation of neuronal apoptosis and the reconstruction of microcirculation after ischemia. The protective effect of HIF-1 alpha and its downstream gene products on cerebral ischemia injury has been widely concerned, but its role in electroacupuncture preconditioning and the mechanism of upstream and downstream regulation and control It's not yet clear.
In this study, middle cerebral artery occlusion (MCAO) was used to simulate focal cerebral ischemia injury, and to study the role and mechanism of HIF-1 alpha in the protection of cerebral ischemia induced by electroacupuncture preconditioning, and to explore the interaction relationship between HIF-1 A and Notch signaling pathway in cerebral ischemia injury. The protective mechanism of ischemic preconditioning by electro acupuncture provides a new theoretical basis for the clinical application of electroacupuncture pretreatment.
Part one
To observe the effect of Electro Acupuncture Pretreatment on HIF-1 alpha before and after ischemia-reperfusion.
Objective:
1. to study the effect of ischemia-reperfusion injury on the expression of HIF-1 alpha.
2. to study the effect of electroacupuncture pretreatment on the expression of HIF-1 alpha before and after ischemia-reperfusion.
Method锛
本文编号：1982728
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/1982728.html
最近更新
教材专著
