谷氨酰胺转运体ASCT2在MYCN扩增的神经母细胞瘤中的生物学功能及分子调控机制研究

发布时间：2018-06-07 05:21

  本文选题：神经母细胞瘤 + MYCN扩增　； 参考：《华中科技大学》2014年博士论文

【摘要】：第一部分谷氨酰胺转运体ASCT2在MYCN扩增的神经母细胞瘤中的生物学功能研究 背景和目的：神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)是儿童中常发的实体肿瘤。约25%的肿瘤病患癌基因MYCN扩增。MYCN扩增的NB预后差,对常规化疗药物高度耐药。目前尚无理想药物有效治疗癌患群体。进一步深入研究此类肿瘤发生发展的分子机制,寻找新的药物靶点,意义重大。我们前期研究发现MYCN扩增的NB细胞对谷氨酰胺成瘾,需要大量外源性谷氨酰胺赖以存活。谷氨酰胺成瘾使得MYCN扩增的NB细胞必须依赖活跃的转运体系补给生长存活所需的谷氨酰胺。然而,MYCN扩增的NB通过何种载体转运谷氨酰胺及其确切的分子调控机制如何,目前尚不清楚。本研究发现ASCT2(solute carrier family5, SLC1A5)是负责MYCN扩增的NB细胞中谷氨酰胺转运的关键载体。因此,这部分我们旨在深入研究ASCT2在MYCN扩增的NB中的生物学功能,以期为抗癌药物研发提供新的靶标。 方法：MYYCN扩增的NB细胞株Kelly. BE-2C和NLF作为体外细胞模型,采用细胞记数仪检测细胞生长情况,结晶紫染色检测克隆形成,台酚蓝染色检测细胞活力,采用PI-Annexin V试剂盒检测细胞凋亡率,BrdU法检测细胞周期,氨基酸摄取实验测定[3H]-L-谷氨酰胺摄取率变化,代谢分析试剂盒检测细胞体内谷氨酸、琥珀酸、延胡索酸的水平；采用RNA干扰抑制ASCT2基因表达,荧光定量PCR法及Western-blot法检验基因表达受抑制情况,同时Western-blot法检测ASCT2沉默后p70S6K、p4E-BP1表达量的变化,采用裸鼠移植瘤模型,测量瘤重变化,通过免疫组化检测肿瘤组织中PCNA和c-Caspase-3的表达量的变化。 结果： 1.谷氨酰胺缺失细胞生长和存活明显抑制,克隆形成明显减少,α-酮戊二酸(α-KG)或者非必需氨基酸(NEAA)能明显的挽救谷氨酰胺剥夺引起的细胞死亡,但是并不能恢复细胞的增殖能力,但同时补充α-KG和NEAA能完全恢复细胞的增； 2.天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺明显抑制细胞的谷氨酰胺摄取,BCH、MeA1B、组氨酸对其摄取没有影响,L-γ-谷氨酰对硝基苯胺(GPNA)浓度依赖性抑制谷氨酰胺摄取； 3.沉默三株细胞的ASCT2基因,谷氨酰胺的摄取率均下降50%以上,细胞体内谷氨酸、琥珀酸、延胡索酸的水平明显下降； 4.成功构建ASCT2表达沉默的稳定细胞系,ASCT2的mRNA和蛋白水平均显著下降,其抑制率大于80%左右,ASCT2基因沉默三株细胞的生长明显抑制,检测kelly细胞的凋亡率,发现缺失40hr的细胞凋亡率增加了29.71%,G1期细胞比例明显增大,S期细胞比例降低。ASCT2沉默后70S6、70S6K、4E-BP1的磷酸化水平明显下降,表明ASCT2在nTORC1信号通路的激活过程中发挥重要作用； 5.稳定敲除ASCT2的神经母细胞瘤体生长显著缓慢于空载体对照组,其肿瘤组织中PCNA表达下降,c-Caspase-3升高,表明ASCT2沉默后通过抑制肿瘤细胞增殖,促使凋亡从而抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力。 结论： 1.MYCN扩增的NB细胞依赖提高的谷氨酰胺代谢维持细胞的增殖和存活； 2. ASCT2主要介导MYCN扩增的NB的谷氨酰胺转运； 3. ASCT2对于MYCN扩增的NB细胞mTORC1信号通路的激活和三羧酸循环的回补是必需的； 4. ASCT2功能缺失显著抑制MYCN扩增的NB细胞增殖和存活,抑制体内肿瘤的发生,证实ASCT2在MYCN扩增NB的发生发展过程中发挥重要作用,我们的研究结果表明,ASCT2可作为治疗MYCN扩增的NB的潜在靶点。 第二部分N-Myc和ATF4对ASCT2勺调控机制及临床意义的研究 背景和目的：我们在第一部分研究中证实ASCT2是维持MYCN扩增的NB细胞谷氨酰胺转运的关键因子。然而其调控机制如何?我们发现MYCN高拷贝和高风险神经母细胞瘤的ASCT2表达显著增高,表明N-Myc可能调控ASCT2的表达。但癌基因MYC是调控肿瘤细胞过表达ASCT2的唯一关键因子吗?通过信息生物学分析,我们发现活化转录因子-4(ATF4)可能是参与ASCT2表达调控的另一关键因子。这些结果与临床分期和预后是否存在相关性?因此这一部分我们将深入研究N-Myc和ATF4对ASCT2的调控作用机制及其临床意义。 方法：荧光定量PCR法、Western-blot法检测验证N-Myc,ATF4对细胞内源性ASCT2表达的影响和应激状态下ASCT2mRNA表达水平的变化,采用生物信息学方法分析ASCT2上的潜在结合位点,构建N-Myc, ATF4与ASCT2基因结合的潜在位点的野生型与突变型荧光素酶报告基因质粒,检测相对荧光素酶活性的变化,研究N-Myc, ATF4对ASCT2转录活性的影响,通过染色质免疫沉淀实验(ChIP)研究N-Myc, ATF4与ASCT2DNA动态的相互作用。通过NB的临床样本基因芯片(microarray)分析NB的ASCT2, MYCN和ATF4mRNA表达,利用http://pob.abcc.ncifcrf. gov/cgi-bin/JK网站的NB基因芯片数据库的整合分析(Meta-Analysis)结果研究ASCT2与NB预后关系,采用免疫组织化学法(IHC)检测NB病理组织切片中N-Myc,ATF4,ASCT2,PCNA蛋白的表达。 结果： 1.MYCN基因沉默时,无论是mRNA水平还是蛋白水平,其ASCT2的表达量均会下降,有统计学意义(P0.001),N-Myc可直接结合在ASCT2启动子区域,在转录水平促进ASCT2的表达； 2.在葡萄糖、谷氨酰胺缺失和衣霉素(tunicamycin,Tm)作用下,ASCT2mRNA表达水平显著升高,而低氧条件下ASCT2的表达没有变化； 3.ATF4基因时沉默,当谷氨酰胺缺失其ASCT2的表达不再呈升高趋势,与对照组在谷氨酰胺缺失时相比显著下降(P0.001),ATF4蛋白在应激和非应激状态下能够与ASCT2的第一个内含子上结合位点直接相互作用并激活其表达； 4.与MYCN单拷贝或者风险度较低的NB样本相比,MYCN扩增的高危组的肿瘤组织中的MYCN、ASCT2、ATF4mRNA的相对表达显著升高(P0.001)； 5. ASCT2基因表达高的病例在Kaplan-Meier生存曲线分析中显示出较短的生存时间； 6. N-Myc、ATF4、ASCT2、PCNA在三例Ⅰ期分化程度比较好的NB组织中表达量都很低,而在13例分化差的样品中其表达都较高。 结论：转录因子N-Myc直接激活ASCT2表达,ATF4在应激和非应激状态下均可直接激活ASCT2表达。N-Myc和ATF4共同参与ASCT2的调控促进NB的恶性演化。ASCT2与NB的恶性程度以及不良预后呈显著正相关,表明ASCT2可作为临床诊断和预后判断的一个新的分子标志物。
[Abstract]:Part I biological function of glutamine transporter ASCT2 in MYCN neuroblastoma
Background and objective: neuroblastoma (NB) is a common entity tumor in children. About 25% of the oncogene MYCN amplification by.MYCN is poor in the prognosis of NB, and is highly resistant to conventional chemotherapeutic drugs. The search for new drug targets is of great significance. Our previous study found that MYCN amplified NB cells were addicted to glutamine and needed a large number of exogenous glutamine to survive. The glutamine addiction made MYCN amplified NB cells depend on the active transport system to recharge the required glutamine for growth and survival. However, MYCN amplified NB passed. It is not clear which carrier to transport glutamine and its exact molecular regulation mechanism. This study found that ASCT2 (solute carrier family5, SLC1A5) is the key carrier of glutamine transport in MYCN amplified NB cells. Therefore, we aim to study the biological function of ASCT2 in MYCN amplification of NB, with a view to it. It provides a new target for the research and development of anticancer drugs.
Methods: MYYCN amplified NB cell line Kelly. BE-2C and NLF were used as cell model in vitro, cell growth was detected by cell number meter, crystal violet staining was used to detect clones, cell vitality was detected by trypan blue staining, cell apoptosis rate was detected by PI-Annexin V kit, cell cycle was detected by BrdU method, and [3H]-L was measured by amino acid uptake test. - the change of glutamine uptake rate, metabolic assay kit was used to detect the level of glutamic acid, succinic acid and fumaric acid in cells. RNA interference was used to inhibit ASCT2 gene expression, fluorescence quantitative PCR method and Western-blot method were used to test the inhibition of gene expression, and Western-blot method was used to detect the changes of p70S6K, p4E-BP1 expression after ASCT2 silencing. The tumor weight was measured by nude mice xenograft model, and the expression of PCNA and c-Caspase-3 in tumor tissues was detected by immunohistochemistry.
Result锛，

本文编号：1989989