microRNA-584-3p和microRNA-let-7f调控胶质瘤细胞低氧诱导血管生成拟态的机制研究

发布时间：2018-06-08 10:30

本文选题：microRNAs + 人脑胶质瘤　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景人脑胶质瘤(Glioma)是最常见的原发颅内恶性肿瘤,发病率高达十万分之五左右,约占所有颅内原发中枢神经系统肿瘤的50%左右,而超过一半患者为高度恶性且预后较差的胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)。目前治疗方法仍以显微手术切除和术后早期的辅助放、化疗为主,即使经过系统的综合治疗之后,脑胶质瘤(尤其是高级别胶质瘤)复发率仍较高,预后较传统治疗没有实质性改善,普遍较差。近年来,随着脑胶质瘤基础及临床研究的深入,基于抗肿瘤侵袭、抗肿瘤血管生成、抗肿瘤癌基因和肿瘤抑制性免疫微环境的多种治疗策略在体外细胞实验及动物实验中都取得了一定的成果。然而由于人脑胶质瘤所具备的极强的恶性增殖能力、耐药性、侵袭性及免疫抑制微环境等特点,至今相关的临床实验仍未显著延长患者生存期并明显改善患者的预后。脑胶质瘤的增殖须有足够的血液供应来维持,所以针对脑胶质瘤血管生成的机制及研究一直是目前胶质瘤治疗研究讨论的热点之一。然而,在细胞实验及动物实验中证实有明显治疗作用的研究成果,如抗VEGF药物等抗肿瘤血管生成治疗在实际的临床试验中并未达到预期的治疗效果。近年来,许多团队通过大量研究发现,以脑胶质瘤为代表的恶性实体肿瘤中存在着一种新的血管生成机制,即血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)。随着对脑胶质瘤血管生成机制的研究进展,越来越多的证据表明,这种非典型的血管生成机制可能是以抗VEGF为代表的多种抗肿瘤血管生成疗法失败的原因之一。因此,进一步深入研究血管生成拟态,阐明其主要的调控通路,找到并阻断促进拟态血管形成的关键靶点,可能会为抗胶质瘤血管生成疗法提供新的策略。多项研究发现人脑胶质瘤,尤其是高级别胶质瘤具有非常活跃的血管生成能力,但是这种丰富的血供对增殖代谢旺盛的胶质瘤细胞而言仍相对不足,因此,在肿瘤实体内的胶质瘤细胞普遍处于低氧状态。低氧状态是实体恶性肿瘤的重要特征之一,在人脑胶质细胞瘤组织中,低氧区域广泛存在,并且与胶质瘤的生物学特性密切相关。国内外大量研究表明,低氧对胶质瘤的影响表现在不但能够显著上调脑胶质瘤细胞的增殖以及增强肿瘤细胞侵袭迁移能力等方面,而且它作为促进血管生成的使动因素,可以诱导胶质瘤细胞上调VEGF等多种促血管生成因子,以形成新的肿瘤血管,为肿瘤的生长提供物质基础来源。然而血管生成拟态作为一种完全不同的新型血管生成模式,其重要性受到越来越多的关注。血管生成拟态是高侵袭性实体肿瘤特有的血管生成方式之一,形成过程中无血管内皮细胞的参与,仅依靠部分高侵袭肿瘤细胞及肿瘤干细胞自身的迁移和形态学转化等方式,形成一种类似血管样的网状结构通道,进而为肿瘤细胞的生长提供血液供应。由于不依靠内皮细胞的参与,这种由肿瘤细胞自身组成的拟态血管不但形成迅速,而且具有较强的血液供应能力,能够满足肿瘤细胞对物质和能量代谢的直接需求。肿瘤细胞形成的血管生成拟态这种非典型血管特性可能是导致抗肿瘤血管生成治疗效果不佳的重要原因之一。尽管已有研究报道了调控血管生成拟态的多个分子通路,但具体分子通路仍未明确,需进一步深入的研究。本研究在对脑胶质瘤低氧环境的研究过程中发现,低氧是促进胶质瘤血管生成拟态形成的重要使动因素之一,而低氧诱导的多种微小RNA(microRNA)也参与了这一调控过程。microRNAs一直是近年来人脑胶质瘤的研究热点,它在细胞代谢、增殖、凋亡、死亡等各种生物学过程中均发挥着重要的调控作用。microRNAs为一类短小的单链内源性非编码RNA,是一种转录后调控基因,它的调控过程主要是通过与靶基因的3’端非翻译区中的特异性种子序列相结合,诱导该基因的信使RNA(mRNA)的降解或翻译抑制,从而调控肿瘤细胞的生物学活性。所以,目前普遍应用于细胞学实验中的微小RNA就是依据不同的实验目的利用这一原理而设计的。由于脑胶质瘤的增殖特性,研究表明胶质瘤组织微环境中的严重低氧状态能够显著影响肿瘤细胞中microRNA的表达。血管生成拟态形成的关键环节就是肿瘤细胞的迁移和肿瘤细胞形态学转化,因此,参与胶质瘤细胞侵袭、迁移的microRNA以及相关靶基因,在低氧对脑胶质细胞瘤血管生成拟态的调控中起到重要作用。其中,我们首次发现microRNA-584-3p和microRNA-let-7f能够显著抑制胶质瘤细胞低氧诱导血管生成拟态的形成,并同时参与了胶质瘤细胞侵袭迁移的调控过程。除了极强的血管生成能力,人脑胶质母细胞瘤具有较高的侵袭特性,它也是导致胶质瘤恶性程度进展的重要原因之一。胶质瘤细胞的形态转化及生物学特性与本身的侵袭特性与迁移密切相关,而较强的侵袭性是胶质瘤的重要恶性表型之一。近年研究表明具有上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymaltransition, EMT)的肿瘤细胞恶性程度更高,另外,肿瘤细胞模拟血管内皮细胞参与形成拟态血管表型的整个过程,本质就是上皮与间充质间的相互转化。因此,在拟态血管形成过程中,调控胶质瘤细胞侵袭、迁移和EMT的分子及信号转导通路可能起到比较重要的作用。所以,与胶质瘤细胞侵袭、迁移相关的microRNAs在胶质瘤细胞血管生成拟态形成过程中也应该具有重要的调控作用。本研究课题揭示并探讨了低氧诱导的人脑胶质母细胞瘤细胞血管生成拟态增强的现象,并进一步研究了与之相关的关键调控microRNAs及其具体分子作用机制。本研究主要分以下几部分：首先,我们研究了低氧对胶质母细胞瘤细胞血管生成拟态形成的促进作用,以及血管生成拟态与胶质瘤细胞侵袭迁移能力之间的密切关系；然后,利用我们前期研究中发现并证实在胶质母细胞瘤中具有侵袭迁移调控作用的microRNAs (microRNA-584-3p和microRNA-Let-7f)进行了血管生成拟态的相关检测,证实了二者在抑制低氧对胶质母细胞瘤血管生成拟态上调中的作用；最后,对microRNA-584-3p和microRNA-Let-7f调控胶质母细胞瘤细胞低氧诱导血管生成拟态的具体分子机制进行了进一步的研究和探讨。本课题旨在为人脑胶质细胞瘤的抗血管生成治疗提供新的靶点方面理论依据。第一部分microRNA-584-3p通过调控ROCK1抑制人脑胶质瘤细胞低氧诱导血管生成拟态(VM)的机制研究1.通过统计不同级别的胶质瘤(WHO分级)患者组织标本中VM阳性表达,分析其与胶质瘤级别的相关性。首先,收集胶质瘤组织标本以及正常脑组织标本(WHO分级I级8例、II级28例、III级15例、IV级30例,以及正常脑组织对照3例),分别进行石蜡切片免疫组织化学染色(CD34+PAS双染法),检测各组织标本中VM的阳性率。结果显示：VM的阳性率与胶质瘤WHO分级具有相关性,高级别脑胶质瘤VM的阳性率明显高于低级别脑胶质瘤,结果有统计学差异。2.通过定量检测VM阴性及阳性胶质瘤患者组织标本中microRNA-584-3p的表达,分析其表达差异性。依据VM的表达将患者肿瘤组织分为阴性表达组和阳性表达组,提取其总RNA,然后通过定量Real-Time PCR检测这些标本中microRNA-584-3p的表达水平。结果提示：VM阳性患者的microRNA-584-3p表达水平显著低于VM阴性患者的microRNA-584-3p表达水平,差异具有统计学意义(P0.05)。3.结合患者的生存资料研究VM表达与胶质瘤术后生存期之间的关系通过对胶质瘤患者的随访,统计病人生存期,依据VM的免疫组化染色结果将患者分为VM阴性组和VM阳性组,然后将两组患者进一步行Kaplan-Meier生存分析,结果发现VM阳性表达患者的预后较差,显著低于VM阴性表达患者的生存期(p0.01),中位生存期仅为328天(其中仅高级别III级和IV级患者的VM阳性组中位生存期为281天)。4.通过对microRNA-584-3p的过表达及敲除,研究其对胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移能力、细胞骨架和血管生成拟态的作用和影响。通过应用人脑胶质母细胞瘤细胞系A172和U87转染microRNA-584-3p过表达(Mimics)和敲除(Inhibitor)后,使用CCK8法实验检测其过表达和敲除对细胞活性的影响,结果发现转染后两者对两种细胞系细胞活性没有明显影响。将人脑胶质母细胞瘤细胞系A172细胞进行microRNA-584-3p过表达和敲除的转染,然后使用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行免疫荧光染色,结果表明microRNA-584-3p能显著抑制胶质瘤细胞的极性,使细胞内张力纤维消失并变为一种圆形的形态；另外我们将转染后的A172细胞接种于Matrigel基质胶包被的96孔板中,观察接种后6小时的血管生成拟态情况,结果发现microRNA-584-3p能显著抑制胶质瘤细胞的血管生成拟态形成,而敲除microRNA-584-3p则能显著促进血管生成拟态的发生。5.研究低氧对胶质母细胞瘤血管生成拟态的影响同样将胶质瘤细胞系A172细胞和U87细胞接种于Matrigel基质胶包被的96孔板中,接种后在低氧培养箱内培养6小时,观察血管生成拟态形成情况,培养结果发现低氧能够显著促进血管生成拟态形成。6.研究microRNA-584-3p过表达及敲除对低氧下胶质母细胞瘤血管生成拟态的影响将胶质瘤细胞系A172细胞和U87细胞进行microRNA-584-3p的过表达和敲除转染,然后分别接种于Matrigel基质胶包被的96孔板中,置于低氧培养箱条件下培养。动态观察两种细胞系血管生成拟态随时间的变化(A172细胞观察时间点为4h、6h、10h、12h; U87细胞观察时间点为6h、8h、10h、12h)。结果发现,microRNA-584-3p过表达能完全抑制胶质瘤细胞的血管生成拟态形成,而敲除microRNA-584-3p能显著促进血管生成拟态的形成,并将血管生成拟态形成时间显著提前。7.研究microRNA-584-3p对低氧环境下胶质母细胞瘤血管生成拟态形成的调控机制我们前期研究发现：ROCK1是microRNA-584-3p的直接作用靶点,而药物Y27632可特异性抑制该靶分子；本研究应用药物Y27632抑制ROCK1后,结果表明应用药物后能够抑制胶质瘤细胞血管生成拟态形成,且抑制效果比microRNA-584-3p过表达后更为显著。而microRNA-584-3p的敲除对胶质母细胞瘤细胞血管生成拟态形成的促进作用也可被Y27632抑制ROCK1后阻断。低氧组的抑制效果同样显著。综上所述,本研究结果表明：人脑胶质瘤标本中VM阳性表达率随着胶质瘤级别升高而升高,并且VM阳性表达的胶质瘤患者术后1年生存率较VM阴性表达患者显著降低,由此可见VM可能是评估胶质瘤患者预后的潜在指标；VM阳性表达的胶质瘤患者的microRNA-584-3p的表达水平显著低于VM阴性表达者,过表达microRNA-584-3p能够显著抑制胶质瘤细胞VM的形成,而敲除microRNA-584-3p则能显著促进VM的形成,并将VM形成的时间显著提前；抑制ROCK1能阻断VM的形成及microRNA-584-3p敲除对胶质母细胞瘤VM形成的促进作用,因此ROCK1可能是microRNA-584-3p调控VM形成的下游靶分子。所以本研究提示,microRNA-584-3p通过抑制ROCK1来阻断胶质母细胞瘤低氧诱导VM的形成,是一个抑癌基因。第二部分microRNA-Let-7f通过调控POSTN抑制人脑胶质瘤细胞低氧诱导血管生成拟态(VM)的机制研究1.统计不同WHO级别的胶质瘤患者组织标本中VM阳性表达率并分析其与胶质瘤级别的相关性同第一部分实验方法,使用石蜡切片免疫组织化学染色(CD34+PAS双染法)检测45例患者的胶质瘤组织标本(WHO分级I级4例、II级8例、III级13例、IV级20例、以及正常脑组织对照2例),结果同样显示：VM的阳性率与胶质瘤WHO分级具有相关性,发现VM的阳性率随着胶质瘤级别升高而升高,结果具有统计学差异。2.检测VM阳性和阴性表达胶质瘤患者组织中microRNA-let-7f的表达差异同理提取45例患者肿瘤组织标本总RNA,然后通过定量real-time PCR检测这些标本中microRNA-let-7f的表达水平,结果表明：VM阳性患者的microRNA-let-7f表达水平显著低于VM阴性患者microRNA-let-7f表达水平(p0.05)。3.结合患者的生存资料研究VM与胶质瘤术后生存期之间的关系同理通过随访45例胶质瘤患者的生存期,根据VM的免疫组化染色结果,将胶质瘤患者分为VM阳性组和VM阴性组两组,然后进行Kaplan-Meier生存分析,结果同样显示VM阳性组的胶质瘤患者术后1年生存率较VM阴性患者显著降低(p0.05)4.研究microRNA-let-7f敲除及过表达对细胞活性、侵袭迁移及血管生成拟态的影响①利用CCK8法检测发现microRNA-let-7f过表达和敲除对转染后人脑胶质瘤细胞系A172细胞活力没有影响。②利用Transwell迁移实验及划痕实验检测常氧下microRNA-let-7f过表达和敲除对转染后人脑胶质瘤细胞系A172细胞的迁移能力的影响,结果显示microRNA-let-7f能显著抑制胶质瘤细胞的迁移能力。③同样将microRNA-let-7f过表达和敲除转染的A172细胞接种于被Matrigel基质胶包被的96孔板中,培养观察6小时后发现：过表达microRNA-let-7f能显著抑制A172细胞的血管生成拟态形成,而敲除microRNA-let-7f则能明显促进血管生成拟态的发生。因而,结果表明microRNA-let-7f能够显著抑制人脑胶质瘤细胞VM的形成。5.研究microRNA-let-7f调控低氧下人脑胶质瘤细胞血管生成拟态的分子机制将人脑胶质瘤细胞系A172细胞经过microRNA-let-7f过表达和敲除转染后,分别接种于Matrigel基质胶包被的96孔板中,置于常氧或低氧条件下培养。观察两种细胞系血管生成拟态随时间变化的特点(A172观察时间点为4h、6h、10h、12h)。结果显示：microRNA-let-7f过表达能明显抑制胶质瘤细胞的血管生成拟态形成,而敲除microRNA-let-7f能显著促进血管生成拟态的发生,并将血管生成拟态形成时间显著提前。根据我们前期研究发现,microRNA-let-7f直接作用靶点是POSTN。我们通过使用该靶点分子的小干扰RNA(siRNA)抑制POSTN,结果显示这能够产生与microRNA-let-7f过表达对胶质瘤细胞血管生成拟态类似的抑制作用,且更为显著；而且siRNA抑制POSTN后,使用microRNA-let-7f敲除对血管生成拟态的促进作用将被阻断。低氧组的抑制效果同样显著。综上所述,本部分研究结果显示：人脑胶质瘤标本中VM阳性表达的患者microRNA-let-7f的表达水平显著低于VM阴性表达者；通过敲除及过表达microRNA-let-7f转染细胞实验表明microRNA-let-7f能够抑制人脑胶质瘤细胞VM的形成。microRNA-let-7f直接靶点是POSTN,通过使用该靶点分子的小干扰RNA抑制POSTN,结果显示这能够产生与microRNA-let-7f过表达对胶质瘤细胞血管生成拟态类似的抑制作用,且更为显著；而且siRNA抑制POSTN后,使用microRNA-let-7f敲除对血管生成拟态的促进作用将被阻断,低氧组的抑制效果同样显著。所以本研究显示,microRNA-let-7f通过调控POSTN抑制人脑胶质瘤细胞低氧诱导血管生成拟态(VM)的形成,也是一个抑癌基因。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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