IGF-1缓解紫杉醇诱发的背根神经节神经元毒性的实验研究

发布时间：2018-06-11 17:33

  本文选题：紫杉醇 + 神经毒性　； 参考：《山东大学》2014年硕士论文

【摘要】：紫杉醇(paclitaxel, PT)是临床上常用的抗肿瘤药物,具有很好的抗肿瘤治疗效果,但PT的神经毒性作用或PT诱发的周围神经病变可使病人出现严重的神经病理性疼痛症状,而且这种疼痛症状用常规的镇痛药物难以缓解,严重影响进一步抗肿瘤治疗。到目前为止,PT的神经毒性作用或PT诱发的周围神经病变的发病机制还未完全被阐明。PT诱发的神经病理性疼痛症状与背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)初级传入神经元的毒性有关。因此,研究PT对DRG神经元表型变化的影响对于阐明PT的神经毒性作用机制具有一定的指导意义,探讨缓解PT的神经毒性作用有助于开发PT诱发的周围神经病变新的治疗手段。本研究利用体外培养的DRG神经元和PT诱发的大鼠周围神经病变模型研究胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)缓解PT诱发的神经毒性及其机制。 第一部分 IGF-1对具有紫杉醇毒性的培养的背根神经节神经元的保护作用 根据神经生化免疫反应的特殊标记可将DRG神经元分为神经肽免疫反应(neuropeptide-immunoreactive, NP-IR)和神经丝免疫反应(neurofilament-IR, NF-IR)神经元两种主要表型。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是一种在DRG神经元内表达并发挥多种生物学功能的感觉神经肽,CGRP-IR神经元可代表NP-IR神经元。神经丝(neurofilament, NF)是神经元特异性中间丝,其中神经丝蛋白-200(neurofilament-200,NF-200)对正常神经元的维持发挥重要作用,NF-200-IR神经元可代表NF-IR神经元。PT是否能够影响DRG神经元的神经化学表型目前仍不清楚。 IGF-1是一种促生长的肽类激素,通过激活其酪氨酸激酶受体IGF-1R促进神经元的存活。IGF-1及其受体IGF-1R均在DRG神经元有表达,IGF-1在促进DRG神经元轴突的生长及调控感觉神经肽的表达方面发挥重要作用。IGF-1是否通过细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinasel/2, ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)／丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase, Akt)信号通路调节PT诱发的DRG神经元的表型变化尚需进一步探讨。 为了检测PT神经毒性作用的剂量依赖关系,将原代培养48h的DRG神经元分为以下各组：(1) PT0.01μmol/L;(2) PT0.1μmol/L;(3) PT1μmol/L;(4)对照组：DRG神经元仅在培养液内孵育作为对照。DRG神经元在以上条件下继续培养24h后,在倒置相差显微镜下观察DRG神经元活细胞生长状态,用微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein2, MAP2)进行免疫荧光标记后测量单个神经元突起的长度。结果显示,DRG神经元突起长度的缩短与PT的浓度具有剂量依赖性。 为了检测IGF-1对具有PT毒性的DRG神经元的保护作用,将原代培养48h的DRG神经元分为以下各组：(1) PT(1μmol/L);(2) PT(1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(3)ERKl/2抑制剂PD98059(10μmol/L)+PT (1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(4) PI3K抑制剂LY294002(10μmol/L)+PT (1μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(5)对照组：DRG神经元仅在培养液内孵育作为对照。DRG神经元在以上条件下继续培养24h后,在倒置相差显微镜下观察DRG神经元活细胞生长状态,用MAP2进行免疫荧光标记后测量单个神经元突起的长度,用WST-1检测DRG神经元细胞活力,用Hoechst33342染色法检测DRG神经元细胞凋亡,用MAP2和CGRP或NF-200免疫荧光双标记检测DRG神经元表型的变化,用real-time PCR分析技术检测CGRP mRNA和NF-200mRNA的表达变化,用Western blot分析技术检测CGRP和NF-200蛋白的表达。结果显示,PT可影响DRG神经元的生长状态,使DRG神经元突起的长度变短,细胞活力减低,细胞凋亡率升高,CGRP-IR神经元和NF-200-IR神经元表型的比例、CGRP和NF-200蛋白及其mRNA的水平下降；IGF-1可使具有PT毒性的DRG神经元的突起延长,细胞活力增加,细胞凋亡率降低,IGF-1可挽救PT诱发的CGRP-IR神经元表型的比例下降,但对NF-200-IR神经元表型的变化没有影响；IGF-1对DRG神经元生长状态的改善和对DRG神经元特定表型的影响作用是通过激活ERK1/2和PI3K/Akt细胞信号转导通路而实现的。本研究的结果表明,IGF-1可通过抑制具有PT毒性的DRG神经元凋亡而增加神经元细胞活力和促进神经元突起的生长,IGF-1主要是对支配皮肤的DRG神经元产生保护作用,PT对DRG神经元不同亚群的神经毒性作用以及IGF-1对具有PT毒性的特定神经元表型神经营养作用,为进一步研究IGF-1缓解PT诱发的神经毒性提供了实验依据。 第二部分 IGF-1缓解紫杉醇诱发的神经病理性疼痛的实验研究 由于PT的神经毒性可诱发周围神经病变,这种周围神经病变的神经病理性疼痛症状用常规的镇痛药物难以缓解。因此,通过神经营养的角度改善神经元的功能状态,是缓解这种周围神经病变所致的神经病理性疼痛症状的一个具有研究前景和应用前景的领域。IGF-1对不同神经损伤的改善作用和其特有的神经营养作用,以及IGF-1通过激活特有的细胞信号转导通路而发挥生物学效应的特性,提供了通过干预新的潜在性治疗靶点缓解PT诱发的神经病理性疼痛的可行性。因此,本研究利用腹膜腔注射(intraperitoneally injection, i.p.)PT建立PT诱发的神经病理性疼痛大鼠动物模型,分别鞘内注射IGF-1、ERK1/2抑制剂PD98059+IGF-1、 PI3K抑制剂LY294002+IGF-1,检测各组大鼠触觉痛觉阈值和热痛觉阈值的变化和L4-6DRG神经元CGRP和NF-200及其mRNA的表达变化。结果显示,PT可使大鼠触觉痛觉阈值和热痛觉阈值降低,鞘内注射IGF-1可使大鼠触觉痛觉阈值和热痛觉阈值升高,并使其提前恢复至正常水平,预先鞘内注射ERK1/2抑制剂PD98059或PI3K抑制剂LY294002可阻断IGF-1的效应。PT可使大鼠L4-6DRG神经元CGRP及其mRNA的表达上调,而NF-200及其mRNA的表达下调。而鞘内注射IGF-1后,DRG神经元CGRP及其mRNA的表达趋于正常,而NF-200及其mRNA的表达则不受IGF-1的影响。IGF-1所致的DRG神经元CGRP及其mRNA的表达变化效应可被预先鞘内注射ERK1/2抑制剂PD98059或PI3K抑制剂LY294002所阻断。这些结果表明,IGF-1可通过ERK1/2和PI3K/Akt细胞信号转导通路缓解PT诱发的神经病理性疼痛,这可能是由于IGF-1改善了不同亚群的DRG神经元抑制了促炎症反应神经肽的表达而实现的。IGF-1的这些作用为进一步开发PT诱发的神经病理性疼痛新的治疗策略提供了实验依据。
[Abstract]:The neurotoxic effects of PT on DRG neurons and the pathogenesis of PT - induced peripheral neuropathy have not been fully elucidated .

the first portion

Protective effects of IGF - 1 on cultured dorsal root ganglia neurons with paclitaxel toxicity

Neurofilament - related peptide ( CGRP ) plays an important role in the maintenance of normal neurons . Neurofilament - 200 ( NF - 200 ) plays an important role in the maintenance of normal neurons .

IGF - 1 is a kind of growth - promoting peptide hormone . IGF - 1 and its receptor IGF - 1R play an important role in promoting the expression of IGF - 1 and its receptor IGF - 1R in DRG neurons .

In order to detect the dose - dependent relationship of PT neurotoxicity , the DRG neurons cultured for 48 h were divided into the following groups : ( 1 ) PT0 . 01 渭mol / L ; ( 2 ) PT0 . 1 渭mol / L ; ( 3 ) PT0 . 1 渭mol / L ; ( 4 ) control group : DRG neurons were incubated in culture medium for 24 h .

In order to detect the protective effects of IGF - 1 on DRG neurons with PT toxicity , the DRG neurons cultured for 48 h were divided into the following groups : ( 1 ) PT ( 1 渭mol / L ) ; ( 2 ) PT ( 1 渭mol / L ) + IGF - 1 ( 20 nmol / L ) ; ( 4 ) the expression of CGRP mRNA and NF - 200 mRNA was detected by using the method of Western blot analysis .
IGF - 1 can prolong the number of DRG neurons with PT toxicity , increase the cell viability , decrease the apoptosis rate , and the ratio of IGF - 1 to the PT - induced CGRP - IR neuronal phenotype is decreased , but there is no effect on the changes of the phenotype of NF - 200 - IR neurons ;
IGF - 1 plays a role in improving the growth status of DRG neurons and the effect on the specific phenotype of DRG neurons . The results of this study suggest that IGF - 1 can increase neuronal cell viability and promote neuronal outgrowth by inhibiting the apoptosis of DRG neurons with PT toxicity . IGF - 1 is primarily a protective effect on DRG neurons innervated skin , and the effects of PT on the neurotoxic effects of different subgroups of DRG neurons and the neurotrophism of IGF - 1 on specific neuronal phenotype with PT toxicity provide experimental basis for further study of IGF - 1 response to PT - induced neurotoxicity .

the second part

An experimental study of IGF - 1 in alleviating neuropathic pain induced by paclitaxel

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本文编号：2006103