视神经脊髓炎B细胞相关生物标记物的探讨及LPS对AQP4抗体致病性的影响

发布时间：2018-06-12 16:01

  本文选题：视神经脊髓炎 + 多发性硬化　； 参考：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文

【摘要】：目的： 1.检测视神经脊髓炎（NMO）患者血清及脑脊液中B淋巴细胞活化因子（BAFF）的水平，探讨BAFF能否作为一种生物标记物，以及在鉴别诊断及推测疾病活动性中所起的作用； 2.检测NMO患者外周血中CD1d(hi) CD5+CD19+调节性B细胞的比例，探讨调节性B细胞能否作为NMO和多发性硬化(MS)鉴别诊断的生物标记物，并为发现二者存在不同的免疫机制提供更多理论依据； 3.建立NMO模型，验证水通道蛋白4抗体(AQP4-Ab)的致病性，并为进一步研究提供平台； 4.观察脂多糖(LPS)预处理对AQP4-Ab致病性的影响，探讨小胶质细胞激活在NMO发病中的作用及可能的机制。 方法： 1.收集2012年4月至2013年10月间就诊于解放军总医院门诊及住院部的NMO和MS患者的临床资料，所有患者均为急性复发期。其中NMO44例，MS38例。对照组血清标本来自体检中心健康正常人，共30例，脑脊液标本来自同期住院的非炎性神经系统疾病患者，共15例，采用ELISA法检测脑脊液及血清中BAFF的水平，流式细胞仪技术检测外周血中CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞的比例。 2.利用原代细胞培养技术，培养新生大鼠皮层细胞，AQP4-Ab阳性的NMO患者血清进行干预，通过免疫荧光技术检测培养细胞中MAP2、GFAP、CD11b的表达情况，以观察神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞形态的改变，建立NMO模型。 3.在模型的基础上，，给予LPS预处理，通过免疫荧光技术检测培养细胞MAP2、GFAP、CD11b的表达变化情况，通过ELISA法检测培养上清中TNF-α、IFN-γ水平的变化情况。 结果： 1. NMO组、MS组和对照组血清中BAFF水平分别为250.2±126.9pg/ml、249.6±130.7pg/ml和222.9±126.1pg/ml,三组间两两比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。 NMO组、 MS组和对照组脑脊液中BAFF水平分别为525.8±230.0pg/ml、298.4±141.9pg/ml和141.4±76.2pg/ml，三组两两比较，NMO组和MS组脑脊液中BAFF水平较对照组明显增高，NMO组脑脊液中BAFF水平较MS组明显增高（P 0.05）。且NMO组、MS组的脑脊液中BAFF水平与EDSS评分存在相关性，EDSS评分越高，其脑脊液中BAFF水平越高（r值分别为0.887和0.885）。但是,NMO组脑脊液中BAFF水平与AQP4抗体滴度之间不具有相关性。 2. NMO组、MS组及对照组外周血CD1d(hi) CD5+CD19+调节性B细胞细胞占CD19+B细胞的比例分别为（7.94±4.16）%、（20.61±11.13）%和（19.35±8.04）%，占淋巴细胞的比例分别为（1.61±0.89）%、（2.70±1.21）%和（2.52±1.27）%，三组比较，NMO组外周血CD1d(hi) CD5+CD19+细胞比例最低（P 0.05），MS组与对照组比较无明显变化(P＞0.05)。AQP4-Ab+NMO组和AQP4-Ab-NMO组CD1d(hi) CD5+CD19+细胞占CD19+B细胞的比例分别为（6.8%，1.33-14.2%）和（8.8%，3.5-20.0%），占淋巴细胞的比例分别为（1.43%，0.2-1.9%）和（2.60%，1.07-4.32%），两组比较，AQP4-Ab+NMO组CD1d(hi) CD5+CD19+细胞比例明显偏低（P 0.05）。 3.原代培养新生大鼠皮层细胞，经AQP4抗体阳性患者血清进行诱导，星形胶质细胞肿胀,神经元固缩。小胶质细胞胞体明显增大，有伪足样突起。与空白对照组和正常血清组比较，AQP4抗体阳性血清组GFAP阳性细胞、CD11b阳性细胞中心聚焦区域面积明显增大，MAP2阳性细胞中心聚集区域面积明显减小，GFAP、CD11b阳性细胞周围投射长度明显增长，MAP2阳性细胞周围投射长度明显缩短（P 0.05）。 4. LPS预处理后, AQP4抗体阳性血清对星形胶质细胞和神经元的损伤进一步加重，星形胶质细胞及神经元发生凋亡。与单纯AQP4-Ab阳性血清组比较，LPS预处理+AQP4-Ab阳性血清组MAP2、GFAP免疫荧光阳性中心聚集区域面积明显缩小，MAP2免疫荧光阳性周围投射区域长度明显缩短，GFAP免疫荧光阳性周围投射区域无法测量， CD11b周围投射区域长度明显增加（P 0.05）。CD11b免疫荧光阳性中心聚集区域面积无明显变化(P＞0.05)。脂多糖预处理6h后，培养上清液中TNF-α水平明显升高，而IFN-γ的水平未发生明显变化。 结论： 1.脑脊液中BAFF水平可作为NMO和MS鉴别诊断的生物标记物，并在判定疾病活动性中具有一定价值。 2.外周血中CD1d(hi) CD5+CD19+调节性B细胞可作为NMO和MS鉴别诊断的生物标记物，并提示NMO与MS，AQP4-Ab+NMO与AQP4-Ab-NMO的免疫机制不同。 3.利用AQP4抗体阳性血清与原代培养的新生大鼠脑皮层细胞，可建立NMO模型。 4.LPS预处理后，可激活小胶质细胞，进一步增强了AQP4抗体的致病性。其中可能涉及了复杂的免疫机制，促炎症细胞因子TNF-α扮演了重要角色。
[Abstract]:Objective:
1. to detect the level of B lymphocyte activating factor (BAFF) in the serum and cerebrospinal fluid (CSF) of patients with optic neuromyelitis (NMO), and to explore whether BAFF can be used as a biomarker and to differentiate and speculate on the activity of the disease.
2. to detect the proportion of CD1d (HI) CD5+CD19+ regulatory B cells in peripheral blood of NMO patients and to explore whether regulatory B cells can be used as biomarkers for differential diagnosis of NMO and multiple sclerosis (MS), and to provide more theoretical basis for the discovery of the existence of different immune mechanisms in the two.
3. establish NMO model to verify the pathogenicity of aquaporin 4 antibody (AQP4-Ab) and provide a platform for further research.
4. to observe the effect of lipopolysaccharide (LPS) pretreatment on the pathogenicity of AQP4-Ab, and explore the role and possible mechanism of microglial activation in the pathogenesis of NMO.
Method锛

本文编号：2010240