人水通道蛋白4重组质粒的构建及在HKE293细胞中的稳定表达

发布时间：2018-06-13 12:15

  本文选题：水通道蛋白4 + 视神经脊髓炎　； 参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的：视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO），又名Devic综合征，是中枢神经系统（central nervous system，，CNS）一种严重的特发性炎症性脱髓鞘性疾病，主要表现为单相或复发病程的视神经炎和横贯性脊髓炎。典型特征为病情反复发作，预后较差。NMO的发病机制尚不明确。在北美，非白种人口中NMO患者比例比经典MS（multiple sclerosis，MS）患者的高。在亚洲，视神经脊髓型MS是一种常见的炎性脱髓鞘疾病，在日本它大约占MS的5-40％。亚洲的视神经脊髓型MS和西方的NMO是同一疾病实体吗？很多呈现NMO初期症状的患者被误诊为MS，但这两种疾病的预后和最佳治疗方案不同。NMO的临床表现较MS严重且预后差。第一次发病后的5年内，约50％的患者需要协助行走，约62％的患者至少一只眼睛失去功能性视力甚至失明，约15-30％的患者死于高颈段脊髓炎诱发的呼吸衰竭和脑干参与的致命性自主神经失调。免疫抑制药物被认为是NMO的最佳治疗，而免疫调节药物是目前推荐的用于早期MS的有效治疗。直到NMO-IgG被发现，其靶抗原为CNS中的水通道蛋白4（AQP4）。AQP4自身抗体的检测在NMO和MS的鉴别诊断中可能发挥重要作用，Wingerchuk新修订的NMO诊断标准更把其作为支持诊断的一个重要指标，但AQP4自身抗体检测的低敏感性和特异性仍是待解决的重要问题。 本研究试图构建人AQP4的重组质粒，并检测其融合蛋白在人胚肾细胞系（HEK293）中的表达，为日后检测NMO患者血清中的AQP4抗体提供一种高敏感性和特异性的实验方法，初步将NMO和MS鉴别开来，使临床治疗更具有针对性和个体化，并可进一步深入挖掘NMO的可能发病机制，为疾病活动、复发和转归的预测提供有意义的基础实验依据。 方法： 1人AQP4基因的获取 1.1引物设计合成：参照Genebank公布的人AQP4基因序列，分别设计其上下游引物，上游引物含NheⅠ酶切位点，下游引物含XhoⅠ酶切位点。以内参β-肌动蛋白（β-actin）作为阳性对照。 1.2脑组织中总RNA的提取：脑组织取自河北医科大学第二医院神经外科手术患者，采用Trizol法提取其总RNA，提取产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并测定其纯度和浓度。 1.3RT-PCR扩增AQP4基因：利用随机引物将总RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模版，利用AQP4特异性上下游引物将cDNA扩增为DNA，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定和纯化。 2重组质粒的构建 AQP4亚型a和空质粒pEGFP-N1分别以限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ双酶切过夜，鉴定酶切产物并回收纯化。将酶切纯化的AQP4和pEGFP-N1用T4连接酶连接，将连接产物转化到感受态细胞--大肠杆菌DH5α，在硫酸卡那霉素抗性LB平板培养过夜，同时以转化pEGFP-N1作为对照。挑取单克隆后扩大培养，然后用质粒提取试剂盒抽提重组质粒。 3重组质粒的鉴定 3.1酶切鉴定：将获得的重组质粒和空质粒分别进行单酶切和双酶切，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测重组质粒经双酶切后是否可切出完整AQP4基因。 3.2测序鉴定：将获得的重组质粒送上海生工测序，测序结果与GenBank中人AQP4序列进行比对。 4细胞转染、鉴定及筛选稳定表达细胞株 4.1HEK293细胞的转染：转染前一天，将合适数量的细胞接种至24孔板，常规培养至70%～80%细胞融合，通过Lipofectamine2000介导将重组质粒转染到HEK293细胞，同时转染pEGFP-N1为对照。 4.2检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达：转染48h后在倒置荧光显微镜下观察重组质粒组、空质粒组和未转染处理组的GFP表达情况。 4.3转染细胞的筛选：转染细胞培养24h后观察瞬时转染效率，同时将800mg/L的G418加入培养液，两周后筛选出稳定表达株，观察稳定转染率。联合应用流式细胞仪分选提高稳定转染率。 5鉴定AQP4在HEK293细胞中的表达 分别采用RT-PCR、Western Blot、间接免疫荧光法鉴定AQP4在HEK293细胞中的基因和蛋白水平的表达情况，进一步将固定的细胞置于激光共聚焦显微镜下观察，确定稳定表达细胞株融合蛋白是否具有膜定位效应。 结果： 1RT-PCR扩增人AQP4基因：RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图可见清晰的特异性扩增条带，与理论预期值相符。 2重组质粒的鉴定：重组质粒的双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后在理论预期值处可见一特异性条带，单酶切产物未见条带；测序结果与理论序列符合率大于99%。 3转染细胞的鉴定及筛选：重组质粒组可见GFP表达且荧光主要位于细胞膜上，空质粒组可见GFP表达且荧光主要位于包浆中，未转染处理组未见GFP表达；G418抗生素联合流式细胞仪筛选使稳定转染效率达90%以上。 4鉴定AQP4在HEK293细胞中的表达： RT-PCR检测AQP4的表达：RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，在972bp处可见一条特异性条带； Western Blot检测AQP4的表达：在转染重组质粒的细胞中提取的蛋白经WB检测分析，在61KD的位置出现特异性条带，而转染空质粒的细胞未见特异性条带；间接免疫荧光法检测AQP4的表达：荧光显微镜下观察进行抗原抗体反应后的转染重组质粒细胞，蓝光激发时细胞表面呈绿色荧光，绿光激发时细胞表面呈现为红色荧光，两者于细胞膜位置重合良好；AQP4-GFP融合蛋白的细胞定位：激光共聚焦显微镜下观察，转染重组质粒的细胞内绿色荧光充满整个细胞,无明显局部定位；转染重组质粒的细胞绿色荧光明显定位于细胞膜区域。 结论： 成功克隆并构建了pEGFP-N1-AQP4重组质粒，并在HEK293细胞中稳定表达，为日后检测NMO患者血清中的AQP4抗体提供了一种高敏感性和特异性的实验方法，并可进一步深入挖掘NMO的可能发病机制，为NMO疾病活动、复发和转归的预测提供有意义的基础实验依据。
[Abstract]:Objective : Neuromyenteric optica ( NMO ) , also known as Devic ' s syndrome , is a severe idiopathic inflammatory demyelinating disease in central nervous system ( CNS ) . It is characterized by recurrent onset of disease and poor prognosis . In Asia , the target antigen is the best treatment for early MS . In Asia , it is considered that the target antigen is the water channel protein 4 ( AQP4 ) in the CNS . The detection of AQP4 autoantibody may play an important role in differential diagnosis of NMO and MS . The low sensitivity and specificity of AQP4 autoantibody detection are still important issues to be resolved .

This study attempts to construct recombinant plasmid of human AQP4 , and to detect the expression of fusion protein in human embryonic kidney cell line ( HEK ) . To provide a high sensitivity and specificity for AQP4 antibody in serum of NMO patients , it is suggested that NMO and MS can be identified separately , which makes clinical treatment more targeted and individualized , and can further explore the possible pathogenesis of NMO . It provides a meaningful basis for predicting disease activity , recurrence and prognosis .

Method :

1 Human AQP4 gene acquisition

1.1 primer design and synthesis : referring to the human AQP4 gene sequence published by Genebank , respectively designing the upstream and downstream primers , the upstream primer containing the Nhe I cleavage site , the downstream primer containing the Xho I cleavage site , and using the internal reference beta - actin ( . beta . - actin ) as a positive control .

1.2 Extraction of total RNA from brain tissue : The brain tissue was taken from the second hospital neurosurgery patient of Hebei Medical University . The total RNA was extracted by Trizol method . The extracted product was identified by agarose gel electrophoresis and its purity and concentration were determined .

1 . The AQP4 gene was amplified by RT - PCR : the total RNA was reversely transcribed into cDNA by using random primers , the cDNA was used as a template , the cDNA was amplified into DNA by using an AQP4 specific upper and downstream primer , and the amplification product was subjected to agarose gel electrophoresis analysis and identification and purification .

Construction of Recombinant Plasmid

The recombinant plasmid was purified by restriction endonuclease Nhe 鈪

本文编号：2013994