瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠的脑保护作用：下调calpain-1、Bax，上调Bcl-2的表达

发布时间：2018-06-15 19:14

  本文选题：脑缺血 + 凋亡　； 参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型,也是成人死亡和残疾的主要原因之一。脑缺血后继发性脑损伤是一个涉及炎症、氧化应激、钙超载、兴奋性氨基酸中毒、细胞凋亡等一系列复杂因素的级联过程,这些因素相互影响,形成对脑组织的二次打击,成为病情加重的主要原因。因此,若以上述级联反应的关键环节为靶点,抑制缺血半暗带细胞的渐进性死亡,可能发挥脑保护作用,具有潜在的临床应用价值。瑞替加滨(retigabine,RTG)目前作为成人部分型癫痫发作的辅助用药,具有稳定神经元静息膜电位、抗兴奋性等特点。除了作为新型抗癫痫药物,瑞替加滨对神经性疼痛、神经退行性病变、肌张力障碍等疾病也具有潜在的临床治疗价值,同时,在培养的海马脑片上使用血清剥夺和血氧剥夺的方法,瑞替加滨可发挥抗氧化作用减少细胞的死亡。我们假设在缺血性脑卒中发生后瑞替加滨通过限制神经元放电活动保存细胞能量,减轻缺血情况下的脑损伤。缺血性脑组织死亡方式除了细胞坏死还包括细胞凋亡。缺血性脑卒中发生后,损伤相对较轻的半暗带区域的细胞可能经历着由基因调控的自主有序的死亡,即细胞凋亡。氧化应激损伤、过度炎症反应、谷氨酸大量释放、钙超载等均有可能触发细胞凋亡信号使细胞产生“自杀”行为。凋亡的细胞在凋亡性核酸内切酶的作用下细胞的DNA被降解,形成凋亡小体。研究表明,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)家族成员之一caspase-3是主要的凋亡“执行者”,其活化后可以裂解多种功能蛋白质导致细胞凋亡。缺血性脑卒中发生后caspase在脑中的表达水平升高,抑制caspase的活化可以减轻缺血性损伤发挥脑保护作用。细胞凋亡的过程涉及到很多促凋亡相关因子的表达及抗凋亡相关因子的抑制。缺血性脑卒中发生后,促凋亡蛋白Bax在脑中的表达水平升高。抑制Bax或过表达抗凋亡蛋白Bcl-2可以减轻缺血性损伤发挥脑保护作用。钙蛋白酶(calpain)是一类钙依赖的半胱氨酸肽链内切酶的总称,可以感受细胞内升高的钙离子浓度而被激活,并通过多种途径引起细胞凋亡。calpain还可以裂解抗凋亡蛋白bcl-2促进细胞凋亡,抑制calpain的活性也能发挥脑保护作用。本研究采用健康成年雄性cd-1小鼠为研究对象,通过线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型,给予瑞替加滨干预后,通过神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织含水量测定,观察瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠是否具有脑保护作用;通过测定小鼠缺血半暗带细胞核dna断裂的情况及cleavedcaspase-3的蛋白表达水平观察瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠脑组织凋亡的影响;通过测定小鼠缺血后脑皮层bax、calpain-1及bcl-2的表达情况观察瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠脑组织中促凋亡、抗凋亡因子的影响,探讨其可能的相关作用机制,为瑞替加滨的进一步研究及临床应用提供理论支持和实验依据。本研究分为三部分,各部分内容概述如下。第一部分瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠的脑保护作用目的:通过对瑞替加滨干预后实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织含水量测定,观察瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠的脑保护作用。方法:1采用健康成年雄性cd-1小鼠为研究对象,通过线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型。将cd-1小鼠随机分为5组:假手术组(sham)、大脑中动脉闭塞组(mcao)、瑞替加滨低剂量组(rtg5)、瑞替加滨中剂量组(rtg10)及瑞替加滨高剂量组(rtg20)。假手术组小鼠接受假手术操作后1小时腹腔注射等量生理盐水;大脑中动脉闭塞组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射等量生理盐水;瑞替加滨低剂量组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射瑞替加滨5mg/kg;瑞替加滨中剂量组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射瑞替加滨10mg/kg;瑞替加滨高剂量组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射瑞替加滨15mg/kg。各组小鼠于手术造模后24小时进行神经功能缺损评分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,ttc)染色测定脑梗死体积,干湿重法测定脑组织含水量。2为进一步探讨瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠的脑保护作用时间窗,我们也观察了在脑缺血发生后不同时间给予瑞替加滨干预对小鼠缺血性脑损伤的影响。将cd-1小鼠随机分为5组:大脑中动脉闭塞组(mcao)、瑞替加滨缺血后即刻用药组(rtg-0h)、瑞替加滨缺血后1小时用药组(rtg-1h)、瑞替加滨缺血后2小时用药组(rtg-2h)、瑞替加滨缺血后3小时用药组(rtg-3h)。大脑中动脉闭塞组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术;瑞替加滨缺血后即刻用药组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后即刻腹腔注射瑞替加滨10mg/kg;瑞替加滨缺血后1小时用药组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射瑞替加滨10mg/kg;瑞替加滨缺血后2小时用药组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后2小时腹腔注射瑞替加滨10mg/kg;瑞替加滨缺血后3小时用药组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后3小时腹腔注射瑞替加滨10mg/kg;各组小鼠在不需要瑞替加滨干预的各个时间点均腹腔注射等量的生理盐水。各组小鼠于手术造模后24小时ttc染色测定脑梗死体积。结果:1sham组小鼠的神经功能缺损评分均为0,mcao组小鼠则明显高于sham组,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg5组和rtg10组小鼠的神经功能缺损评分明显降低,差异有统计学意义(p0.05);rtg15组小鼠神经功能缺损评分较mcao组小鼠无明显改变,差异无统计学意义(p0.05)。2sham组小鼠脑片ttc染色后呈现均匀一致的红色,mcao组小鼠脑片ttc染色后在右侧皮层及基底节区呈现大范围的白色梗死区域。与mcao组小鼠相比,rtg5组和rtg10组小鼠的梗死体积明显减小,差异有统计学意义(p0.05);rtg15组小鼠的梗死体积较mcao组小鼠无明显改变,差异无统计学意义(p0.05)。3脑组织含水量测定结果显示:与mcao组小鼠相比,rtg5组和rtg10组小鼠的脑组织含水量明显减小,差异有统计学意义(p0.05);rtg15组小鼠的脑组织含水量较mcao组小鼠无明显改变,差异无统计学意义(p0.05)。上述结果表明瑞替加滨给药剂量在5mg/kg、10mg/kg时均能够较好的发挥脑保护作用,接下来的实验我们将主要关注瑞替加滨在10mg/kg时的相关作用及机制。4与mcao组小鼠相比,rtg-0h组、rtg-1h组、rtg-2h组及rtg-3h组小鼠的梗死体积明显减小,差异有统计学意义(p0.05)。rtg-0h组、rtg-1h组、rtg-2h组及rtg-h3组小鼠的梗死体积相互比较没有明显改变,差异无统计学意义(p0.05)。上述结果表明瑞替加滨10mg/kg在缺血发生后0-3小时给药均能发挥脑保护作用。第二部分瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠脑组织细胞凋亡的影响目的:通过测定小鼠缺血后半暗带脑细胞核dna断裂的情况及cleavedcaspase-3的蛋白表达水平观察瑞替加滨对实验性脑梗死小鼠脑细胞凋亡的影响。方法:采用健康成年雄性cd-1小鼠为研究对象,通过线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型。将cd-1小鼠随机分为3组:假手术组(sham)、大脑中动脉闭塞组(mcao)、瑞替加滨干预组(rtg)。假手术组小鼠接受假手术操作后1小时腹腔注射等量生理盐水;大脑中动脉闭塞组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射等量生理盐水;瑞替加滨组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射瑞替加滨10mg/kg。各组小鼠于手术造模后24小时tunel试剂盒检测半暗带区域脑细胞核dna断裂的情况,western-blot法检测cleavedcaspase-3蛋白表达情况。结果:1与sham组相比,mcao组小鼠脑组织切片的tunel阳性细胞数明显高于sham组,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠脑组织切片的tunel阳性细胞数明显低于mcao组小鼠,差异有统计学意义(p0.05)。2各组小鼠均有cleavedcaspase-3蛋白的表达;与sham组相比,mcao组小鼠的cleavedcaspase-3表达明显升高,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的cleavedcaspase-3表达明显降低,差异有统计学意义(p0.05)。第三部分瑞替加滨下调实验性脑梗死小鼠脑组织calpain-1、bax,上调bcl-2的表达目的:通过测定实验性脑梗死小鼠脑皮层calpain-1、bax及bcl-2的表达情况观察瑞替加滨对缺血脑细胞促凋亡、抗凋亡因子的影响,探讨其抑制缺血性脑细胞凋亡可能的作用机制。方法:采用健康成年雄性cd-1小鼠为研究对象,通过线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型。将cd-1小鼠随机分为3组:假手术组(sham)、大脑中动脉闭塞组(mcao)、瑞替加滨干预组(rtg)。假手术组小鼠接受假手术操作后1小时腹腔注射等量生理盐水;大脑中动脉闭塞组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射等量生理盐水;瑞替加滨组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1小时腹腔注射瑞替加滨10mg/kg。各组小鼠于手术造模后24小时qrt-pcr检测calpain-1、bax、bcl-2的mrna表达情况,western-blot法及免疫组织化学法检测calpain-1、bax、bcl-2蛋白表达情况。结果:1qrt-pcr结果显示:与sham组相比,mcao组小鼠的calpain-1、bax的mrna表达明显升高,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的calpain-1、bax的mrna表达明显降低,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的bcl-2的mrna表达明显升高,差异有统计学意义(p0.05)。2western-blot结果显示:各组小鼠均有calpain-1、bax、bcl-2蛋白的表达。与sham组相比,mcao组小鼠的calpain-1、bax蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的calpain-1、bax蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(p0.05);与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的bcl-2蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(p0.05)。3免疫组织化学结果显示:各组小鼠均有calpain-1、bax、bcl-2阳性细胞。与sham组相比,mcao组小鼠的calpain-1、bax阳性细胞数升高;与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的calpain-1、bax阳性细胞数降低;与mcao组小鼠相比,rtg组小鼠的bcl-2阳性细胞数升高。结论:1本实验通过线栓法成功建立小鼠永久性右侧大脑中动脉闭塞模型,发现模型建立后1小时腹腔注射瑞替加滨5mg/kg、10mg/kg可以显著降低小鼠的神经功能缺损评分及脑梗死体积,且以该剂量于局灶性脑缺血发生后0-3小时给药均能发挥脑保护作用,为进一步研究瑞替加滨脑保护作用的治疗时间窗提供了实验依据。2瑞替加滨干预可以降低实验性脑梗死小鼠脑组织切片的TUNEL阳性细胞数,抑制脑细胞核DNA的断裂;还可以降低实验性脑梗死小鼠cleaved caspase-3蛋白的表达,抑制caspase-3的活化。从而抑制实验性脑梗死小鼠的脑细胞凋亡,发挥脑保护作用。3瑞替加滨干预可以下调实验性脑梗死小鼠脑细胞的calpain-1、Bax,上调Bcl-2的表达水平,从而抑制缺血性脑细胞凋亡,进一步提示瑞替加滨在脑缺血后可以发挥脑保护作用。
[Abstract]:Ischemic stroke is one of the most common types of stroke and is one of the main causes of death and disability in adults . Objective : To study the effect of retegaine on the brain protection of experimental cerebral infarction mice by means of the method of measuring bax , calpain - 1 and bcl - 2 in brain of mice .
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
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本文编号：2023235