Celf1在模拟强直性肌营养不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分调节作用

发布时间：2018-06-18 14:15

  本文选题：Celf1 + CUGBP1　； 参考：《南昌大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:研究Celf1对模拟强直性肌营养不良RNA毒性致成肌分化缺陷中的部分调节作用。方法:1、C2C12成肌细胞培养与分化,并进行成肌分化诱导。于0,1,2,4,6时间点进行样品收集。2、质粒构建与转染,构建GFP-CUG5和GFP-CUG200质粒,构建后利用脂质体转染入C2C12细胞中;构建p MSCV-Celf1 Flag-puro质粒,将Baylor医学院Tom Cooper提供pc DNA3-Celf1Flag质粒中含有Celf1 Flag的Eco RI片段插入p MSCV-puro质粒,将质粒用293T细胞包装制备逆转录病毒,随后转染C2C12细胞;Celf1 sh RNA慢病毒载体和对照组Scrambled sh RNA病毒由20μg sh RNA编码的慢病毒载体和150μg包装载体ps PAX2以及10μg包膜载体p MD2.G共同转染入150mm培养皿的293T细胞中,收集上清转染C2C12细胞。3、抗体与免疫测定,western blot测定,按常规方法将转膜蛋白转移至硝酸纤维素膜上。先后用Celf1单克隆鼠抗,Flag,Actin一抗孵育及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ig G二抗进行孵育,增强荧光试剂显色。4、实时定量RT-PCR及RT-PCR选择性剪切分析,以GAPDH作为标准对照,测定Myo D(Myf3)、Myogenin(Myo G)、Mef2c、Celf1等基因在成肌分化中的变化。提取总RNA,使用特异性引物扩增Zasp、MBNL-1、Z-TTN、M-TTN、和BIN-1,PCR产物用1%琼脂凝胶分,DNA条带利用Image J软件进行分析。5、流式细胞术及荧光激活细胞分选(FACS),测定成肌细胞增殖及早期分化的细胞周期分布,用胰蛋白酶将细胞消化后,洗涤、固定、染色,并使用Acuri C6流式细胞仪及Flowjo软件和Dean Jett Fox模型对结果及数据进行分析。6、细胞染色量化与统计分析,核融合指数计算方法为肌管内总细胞核数(≥2 nuclei)占总细胞核数百分比。总肌管面积为图像被肌管覆盖区域所占百分比。每组分析至少涵盖1000个细胞核及至少3个随机选择区域,统计数据分析应用t检验评估两组差异性,P0.05。结果:1、3'非翻译区的CUG扩增导致成肌细胞的细胞周期加速和分化损伤(1)α肌凝蛋白重链染色(MF20)可见GFP-CUG5组细胞肌管形成明显,相反,GFP-CUG200肌管形成数量很少;(2)三个独立量化实验结果表明GFP-CUG5组核融合指数达(38.9±8.7)%,而GFP-CUG200组融合指数仅(2.2±0.8)%。同样的,GFP-CUG5组肌管面积达(40.2±12.0)%,而GFP-CUG200组肌管面积仅(3.3±0.8)%;(3)RT-PCR结果显示,CUG200在成肌细胞增殖和早期分化过程中Celf1m RNA表达显著增加,CUG200抑制细胞增殖和分化过程中Myo D的表达,Myo G和Mef2C表达也被抑制,与分化缺失结果一致;(4)Western blot结果显示CUG200组Celf1蛋白水平也相应地上升;(5)FACS分析结果显示,在增殖未分化的成肌细胞中,CUG200的G1期细胞显著减少,细胞周期撤退增加。2、过表达Celf1抑制成肌细胞细胞周期撤退及损伤成肌分化(1)Western blot结果显示,Flag标签Celf1仅出现在p MSCV-Celf1 Flag转换细胞中,其Celf1蛋白表达水平上调;(3)肌管融合指数Celf1Flag组(5.2±2.0)%而对照组为(34.9±11.7)%;肌管面积Celf1Flag组(5.4±3.0)%,对照组(29.8±12.7)%;(4)通过对肌细胞分化过程中基因表达研究,我们发现Celf1过表达会导致未分化的成肌细胞Myo D表达增加,与对照组组相比,即使Myo D在分化处理当日(day0)表达增加,在随后分化第1日(day1)至第6日(day6)Myo D表达明显降低,Myo G及Mef2C表达仍然被抑制,这与肌管形成缺失相符;(5)FACS细胞周期分析显示,30.7%Celf1过表达成肌细胞停留在G1期未分化阶段,而对照组G1期细胞比例43.6%,说明Celf1过表达抑制成肌细胞分化过程中细胞周期撤退;3、敲减Celf1促进早期成肌细胞分化(1)western blot结果显示,与对照组比较,Celf1敲减组Celf1蛋白表达下降;(2)免疫荧光染色结果显示,在分化过程中,肌管在Celf1敲减细胞中形成增加;(3)融合指数和肌管面积分别为(45.0±7.1)%和(38.6±7.2)%,对照组分别为(22.0±1.9)%和(16.1±2.6)%;(4)通过实时定量PCR我们发现Celf1敲减细胞表达是一个循序渐进的过程。Celf1敲减细胞中Myo D,Myo G和Mef2C的表达显著增加,支持成肌细胞分化增加的结果;(5)FACS细胞周期分析显示:增殖期对照组细胞16.0%停留在G1期,而Celf1敲减组为16.4%;4、敲减Celf1部分挽救CUG扩增引起的成肌分化缺陷(1)western blot结果显示,与对照组比较,Celf1敲减组Celf1蛋白表达下降;(2)MF20染色结果显示,Celf1 sh RNA的导入致CUG200组成肌分化增加。与对照组相比,表达Celf1 sh RNA的成肌细胞多核肌管显著;(3)核融合指数从(2.3±1.4)%增加至(17.6±1.1)%,相应地,肌管面积从(4.7±3.1)%增加至(12.7±2.4)%,但Celf1敲减的成肌细胞不能完全恢复至野生型细胞成肌分化程度;(4)实时定量PCR分析Myo D,Myo G和Mef2C也支持Celf1 sh RNA部分挽救CUG扩增导致的成肌分化缺陷;(5)FASC细胞周期分析提示Celf1 sh RNA纠正CUG200异常增加的细胞周期,流式细胞术及荧光激活细胞分选技术结果显示Celf1 sh RNA的CUG200成肌细胞中停留在细胞周期G1期细胞比例为43.3%,显著大于对照组G1期31.5%细胞比例;(6)选择性剪切分析显示,成肌细胞基因表达过程的选择性剪切未完全被Celf1 sh RNA逆转。结论:1、Celf1在调节肌细胞周末分化中起着独立的负性调节作用,是导致RNA毒性作用的部分原因。2、靶向Celf1可能为纠正强直性肌营养不良表型,尤其是成为先天性病例的有效治疗策略。
[Abstract]:AIM : To study the partial regulatory effects of Celf1 on myogenic differentiation induced by acute myotonic dystrophy . Methods : 1 , C2C12 myoblasts were cultured and differentiated . 鏌撹壊,骞朵娇鐢ˋcuri C6娴佸紡缁嗚優浠�鍙奆lowjo杞�浠跺拰Dean Jett Fox妯″瀷瀵圭粨鏋滃強鏁版嵁杩涜�屽垎鏋�.6,缁嗚優鏌撹壊閲忓寲涓庣粺璁″垎鏋，

本文编号：2035763