Gaspase-1抑制剂对实验性自身免疫性重症肌无力的影响与机制研究

发布时间：2018-06-22 09:01

本文选题：Caspase-1抑制剂 + 白介素-1β　；参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景：重症肌无力(Myasthenia gravis, MG)是以损伤神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AChR)为特征,从而导致神经肌肉处传导功能障碍产生肌肉无力的自身免疫性疾病,这个过程是需要自身抗体介导,T细胞依赖,补体参与。为了更好地研究人类MG的发病机制及治疗方法,从电鳐器官中提取AChR,通过皮下免疫Lewis大鼠能够成功地建立实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)动物模型。进一步研究证实,人工合成的大鼠来源的AChR α亚基97-116肽段(R97-116)也可以起到类似作用,通过其皮下注射诱导的EAMG模型临床评分、免疫学特征、电生理学指标及自身抗体水平与从电鳐器官中提取的AChR诱导的EAMG模型非常类似。树突状细胞(dendric cell, DC)、组织巨噬细胞、血液单核细胞等可以产生高效促炎因子IL-1β,这依赖于半胱氨酸天冬氨酸酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase-1, caspase-1)的激活。Pro-IL-1β和pro-IL-18前体需要激活的caspase-1加工、剪接从而成为有活性的成熟形式,而caspase-1的活化需要炎性复合体(inflammasome)的分子复合物的参与。IL-1p和IL-18能够诱导固有免疫细胞包括γδT细胞、NKT细胞分泌IL-17。成熟的IL-1p首先与固有免疫细胞表面的I型IL-1受体结合,然后与IL-1受体辅助蛋白结合形成受体复合物。Toll样受体结构域募集衔接分子MyD88,然后激活NF-κB,激活的NF-kB转移到细胞核内并诱导促炎细胞因子转录。IL-1靶向药物,比如IL-1受体拮抗剂阿那白滞素、IL-1p单克隆中和抗体康纳单抗,能够快速、持久地抑制炎症疾病。C57BL/6 EAMG大鼠每天注射IL-1受体拮抗剂可以通过减少血清IFN-7, TNF-a, IL-1β, C3, anti-AChR IgGl水平抑制EAMG临床症状。最近研究发现caspase-1对固有免疫细胞的IL-17产生起着重要作用。Caspase-1在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)发病机制中的作用已经阐明,在疾病的炎性过程中caspase-1蛋白水平和活性是上调的。Caspase-1基因敲除的小鼠EAE疾病发病率下降,这与Thl细胞受抑制和中枢神经系统血管周围炎性浸润减少有关。在体内实验中,抑制caspase-1可以抑制Th17细胞和EAE的发生,注射IL-1p或者IL-18可以逆转这种现象,注射IL-1p效果更显著。另外,一些研究已经证实激活的caspase-1可以通过分泌IL-1p上调树突状细胞表面的N IHC class Ⅱ、CD80口CD86分子。我们由此推断caspase-1是治疗自身免疫疾病的重要药物。在这个研究中,我们检测了c aspase-1抑制剂对EAMG大鼠的影响,及其在内源性树突状细胞、白介素-1、白介素-17途径中的作用,为MG的治疗提供了新的方向和思路。研究目的：探讨caspase-1抑制剂影响实验性自身免疫性重症肌无力的细胞免疫学机制。研究方法：1.建立EAMG模型及临床分级选择健康的雌性Lewis大鼠,一般6-8周龄,体重160-180 g。用H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂溶解人工合成的大鼠来源的AChR α亚基97-116肽段(R97-116),首先每只大鼠在双后足垫皮下注射免疫剂量200μl,然后首次免疫11天后在每只大鼠背部再次免疫1次,作为强化免疫。每间隔一天采用Lennonl临床评分量表对每只大鼠进行临床分级和称重,这个过程需要采用双盲法。2.动物分组分别设立caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk治疗组、caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk+IL-1β治疗组和EAMG对照组。于第一次免疫后的第13天和第14天分别给予腹腔注射Ac-YVAD-cmk和IL-1β及等体积的灭菌PBS,观察症状直至发病高峰期。3.制备脾脏、骨髓DC及检测通过无菌操作分离、摘取Lewis大鼠的脾脏,在超净台中研磨脾脏组织,过滤、离心获取单个核细胞悬液。用裂解液破坏细胞悬液中的红细胞,离心、冲洗后将细胞悬液转移至培养瓶中,于37℃、5% CO2条件下培养1 h 40 min,平晃培养瓶,使悬浮细胞离壁,弃掉其内液体,冲洗并留取贴壁细胞,加入完全培养液继续培养18h,最后悬浮的细胞即是脾脏树突状细胞。同样的取Lewis大鼠的股骨和胫骨,制备单细胞悬液,加入10 ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4培养8天后收集悬浮的树突状细胞。向培养瓶中加入LPS和Ac-YVAD-cmk(终浓度8μM),对照培养瓶中加入等体积的LPS和溶剂DMSO,培养48 h后收集悬浮的细胞。最后为了验证Ac-YVAD-cmk对DCs作用,分别检测两组DCs表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达及其胞内细胞因子IL-1p的水平。4.制备淋巴结单个核细胞(mononuclear cells, MNC)在EAMG大鼠发病高峰期,无菌操作下分离、获取各组大鼠腹股沟淋巴结,通过研磨过滤、离心,制备MNC悬液,并用细胞计数板计数,通过计算,最终获取细胞浓度为2×106个细胞/ml的细胞悬液。5.通过流式细胞术检测MNC细胞分群按细胞浓度调整每管淋巴结MNC细胞悬液1×106个细胞/管,洗涤细胞后分别加入PE标记的CD4抗体、PerCP标记的CD3抗体、PE标记的γδT抗体、PE标记的OX62抗体,然后用2%多聚甲醛4℃下孵育20 min,0.5%皂甙常温孵育20 min,最后分别加入相应FITC标记的IL-17抗体和FITC标记IL-1p抗体。检测Treg细胞时,洗涤细胞后首先加入表面分子FITC标记的CD4抗体、PE标记的CD25抗体,在4℃下孵育30min。洗涤细胞后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)2 ml/管,4℃下避光孵育过夜。再次洗涤细胞后加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体,在4℃下孵育30 min。Tfh细胞检测加入PE标记的CD4抗体、FITC标记的CXCR5抗体和PE-Cy7标记的ICOS抗体,在4℃下孵育30 min。最后用400 ml PBS重新悬浮细胞,在流式细胞仪上进行检测。6.通过CCK-8试验检测细胞增殖通过每组细胞计数结果,调整细胞浓度,取适量淋巴结MNC细胞悬液,种于96孔板内,均匀分组后每组分别加入ConA、R97-116、1640刺激。在37℃、5% CI2条件下培养72 h后,每孔吸取细胞上清液85μl保存在-20℃条件下,留作细胞因子检测,然后向每孔中加入10μl CCK-8,在37℃、5% CO2条件下孵育4 h,通过酶标仪在450 nm波长下检测其光密度值(OD值)。7.通过ELISA法检测细胞上清液中的细胞因子含量取CCK-8试验中R97-116刺激组淋巴结MNC细胞上清液,通过ELISA方法检测细胞上清液中细胞因子IL-1β、IL-17的含量。8.通过ELISA法检测血清中抗R97-116 IgG抗体水平和亲和性在EAMG发病高峰期处死大鼠,吸取心脏血离心,获取血清,通过ELISA法检测不同组大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体的水平和亲和性。9.通过统计学分析各组大鼠数据通过统计分析软件SPSS 17.0分析各组资料数据,数据结果以均值±标准差(standard deviation, SD)表示。两组间数据比较应用独立样本t检验,三组间数据比较应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA),当P0.05时,视为差异有统计学意义。研究结果：1.体外试验中两组大鼠DCs表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ和IL-1β分子的表达情况在体外试验中,与DMSO对照组相比,caspase-1抑制剂治疗组脾脏DCs低表达CD86、MHC-Ⅱ和IL-1β分子,而且caspase-1抑制剂治疗组骨髓DCs低表达CD80、CD86和IL-1β分子。2.Caspase-1抑制剂可以缓解EAMG大鼠疾病进展并调节其DCs表面分子与EAMG对照组相比,caspase-1抑制剂治疗组EAMG大鼠临床症状明显缓解。Caspase-1抑制剂治疗对EAMG大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体的水平无明显影响,但是降低了抗R97-116 IgG抗体的亲和性。经流式检测发现,caspase-1抑制剂可以降低EAMG大鼠MNC中OX62+DC表面CD86、MHCⅡ分子的表达。3.外源性IL-1β对caspase-1抑制剂治疗EAMG作用的影响与caspase-1抑制剂治疗组大鼠相比较,caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组大鼠临床症状明显加重,而且caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组与EAMG组大鼠临床症状无明显差异。Caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组大鼠检测血清抗R97-116 IgG抗体的水平显著高于EAMG组和caspase-1抑制剂治疗组,而且两个治疗组血清抗R97-116 IgG抗体的亲和性均明显低于EAMG组。另外,EAMG组和caspase-1抑制剂治疗组血清抗R97-116IgG1、G2a、G2b抗体的水平无明显差异,然而c aspase-1抑制剂+IL-1β治疗组血清抗R97-116 IgG1、G2a水平明显高于其他两组。4. Caspase-1抑制剂治疗EAMG通过抑制DC IL-1 p-CD4+T-γδT-IL-17途径与EAMG对照组相比,caspase-1抑制剂治疗组下调了OX62+DC细胞中IL-1β阳性细胞百分比,注射IL-1β仅能够部分逆转这个结果,caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组与EAMG对照组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比,caspase-1抑制剂治疗组减少了CD4+IL-17+细胞百分比,注射IL-1β可部分逆转但没有统计学差异。γδT细胞数量在三组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比,caspase-1抑制剂治疗组下调了γδT细胞中IL-17阳性细胞百分比,但是两个治疗组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比,caspase-1抑制剂治疗组降低了细胞培养上清中IL-1β水平,caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组IL-1β水平较caspase-1印制剂治疗组上调,但没有达到统计学差异。细胞培养上清中IL-17水平三组之间没有明显差异。5. Caspase-1抑制剂对淋巴细胞增殖反应和CD4+CD25+Foxp3+T, CD4+CXCR5+ICOS+T细胞表达的影响结果显示CD4+CD25+Foxp3+T百分比在三组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比,caspase-1制剂治疗组下调了CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分比,caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组与对照组之间没有统计学差异。CCK-8增殖实验显示,在经R97-116抗原刺激或者未经R97-116抗原刺激后,caspase-1抑制剂治疗组的淋巴细胞增殖反应均较对照组明显降低,两治疗组之间没有明显差异。结论：1.在体外实验中,caspase-1抑制剂可以通过减少IL-1β水平降低DCs表面分子CD80、 CD86、MHC-Ⅱ表达抑制DCs成熟。2. Caspase-1抑制剂通过抑制DC IL-1 p-CD4+ T-γδT-IL-17途径,降低抗R97-116 IgG抗体的亲和性,从而抑制EAMG疾病发展。3. Caspase-1抑制剂可以减少CD4+CXCR5+ICOS+T细胞表达。4.注射外源性IL-1β并不能逆转caspase-1抑制剂在EAMG中的作用。意义：本研究发现caspase-1抑制剂通过降低IL-1β水平抑制DCs成熟,减少了Tfh细胞数量,减少了CD4+T、γδT cells IL-17水平,降低了抗R97-116 IgG抗体的亲和性,从而抑制EAMG疾病发展。注射外源性IL-1β并不能逆转caspase-1抑制剂在EAMG中的作用。这为临床上治疗人类MG提供了一种新的思路和方法。研究背景：实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG),是研究人类重症肌无力(myasthenia gravis, MG)发病机制、治疗方法的动物模型,可以通过皮下注射大鼠来源的AChR α亚基97-116肽段诱导。B细胞在二级淋巴器官淋巴小结的生发中心中经过高频突变、高亲和力成熟,诱导浆细胞、记忆B细胞发育。分泌抗体的B细胞被公认为能够促进免疫反应,在MG发病过程中起着重要作用。调节性B细胞在自身免疫疾病中的作用首先在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EA E)中被报道。调节性B细胞(Breg)是具有特定功能的B细胞亚群,能够负向调节免疫反应。调节性B细胞类似于调节性T细胞,可以分为分泌IL-10的B细胞(B10)、分泌TGF-β的B细胞、表达Foxp3的B细胞(B-Foxp3)。滤泡辅助T细胞,CD4+T细胞亚群,能够在生发中心反应中促进B细胞增殖、抗体亲和力成熟。滤泡辅助T细胞以表面分子CXCR5 (CXC chemokine receptor 5)、ICOS (inducibleT-cell costimulator)、PD-1 (programmed death protein-1)为特征,其转录因子Bcl-6 (B cell lymphoma 6)是滤泡辅助T细胞分化、发育的关键调节因子。最近研究发现一部分的滤泡辅助T细胞同时表达Foxp3,被定义为滤泡辅助调节性T细胞,其能够抑制滤泡辅助T细胞功能、生发中心反应。之前的实验主要研究caspase-1抑制剂在EAMG大鼠中对细胞免疫的影响,而本实验进一步研究caspase-1抑制剂对体液免疫的影响。研究目的：探讨caspase-1抑制剂治疗实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的体液免疫机制。研究方法：1. EAMG模型的制备选择健康的雌性Lewis大鼠,一般6-8周龄,体重160-180 g。用H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂溶解人工合成的大鼠来源的AChRa亚基97-116肽段(R97-116),首先每只大鼠在双后足垫皮下注射免疫剂量200μl,然后首次免疫11天后在每只大鼠背部再次免疫1次,作为强化免疫。2.动物分组分别设立EAMG对照组、caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk治疗组,从第一次免疫后的第13天开始隔天给予腹腔注射Ac-YVAD-cmk,对照组给予等体积的灭菌PBS,观察症状直至发病高峰期。3.通过ELISA法检测血清中抗R97-116 IgG抗体水平和亲和性在EAMG发病高峰期处死大鼠,吸取心脏血离心,获取血清,通过ELISA法检测不同组大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体的水平和亲和性。4.制备淋巴结单个核细胞(mononuclear cells, MNC)在EAMG大鼠发病高峰期,无菌操作下分离、获取各组大鼠腹股沟淋巴结,通过研磨过滤、离心,制备MNC悬液,并用细胞计数板计数,通过计算,最终获取细胞浓度为2×106个细胞/m1的细胞悬液。5.通过流式细胞术检测MNC细胞分群按细胞浓度调整每管淋巴结MNC细胞悬液1×106个细胞/管,洗涤细胞后分别加FITC标记的CD4抗体、PE标记的CXCR5抗体、PE-Cy7标记的ICOS抗体,4℃孵育抗体30min,洗涤细胞后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization) 2 ml/管,4℃孵育过夜。再次洗涤细胞后加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体,在4℃下孵育30min。B10细胞检测时洗涤细胞后先加入表面抗体FITC标记的CD19抗体,4℃孵育抗体60 min,然后用2%多聚甲醛4℃下孵育20 min,0.5%皂甙常温孵育20 min,最后加入PE标记的IL-10抗体。检测Breg细胞时,洗涤细胞后首先加入表面分子FITC标记的CD19抗体,在4℃下孵育抗体60min。洗涤细胞后加入固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization) 2 ml/管,4℃下避光孵育过夜。再次洗涤细胞后加入PE标记的Foxp3抗体,在4℃下孵育30 min。最后过滤,用400 ml PBS重新悬浮细胞,在流式细胞仪上进行检测。6.通过ELISA法检测细胞上清液中的细胞因子含量取CCK-8试验中R97-116刺激组淋巴结MNC细胞上清液,通过ELISA方法检测细胞上清液中细胞因子IL-10的含量。7.通过免疫荧光检测淋巴结生发中心用包埋剂将胭窝淋巴结包埋,切片后室温晾干,放入4℃丙酮中固定10min。用0.5%BSA室温封闭切片30min后洗涤切片,分别加入DyLight(?) 594标记的山羊抗大鼠IgM抗体、Fluorescein标记的PNA抗体,4℃孵育过夜。洗涤切片后,用荧光淬灭剂封片,在免疫荧光显微镜上观察结果并拍照保存。8.通过统计学分析各组大鼠数据通过统计分析软件SPSS 17.0分析各组资料数据,数据结果以均值±标准差(standard deviation, SD)表示。两组间数据比较应用独立样本t检验,当P0.05时,视为差异有统计学意义。研究结果：1. Caspase-1抑制剂可以抑制EAMG大鼠抗R97-116 IgG抗体、生发中心反应在免疫后第43天,通过ELISA法检测了对照组和治疗组大鼠血清中抗体水平,两组血清抗R97-116 IgG抗体水平没有统计学差异,但是治疗组抗R97-116 IgG抗体亲和性低于对照组。Caspase-1抑制剂治疗组生发中心PNA+B细胞低于EAMG对照组。2. Caspase-1抑制剂平衡EAMG大鼠中Tfh、Tfr细胞亚群结果显示,与对照组EAMG大鼠相比,caspase-1抑制剂治疗组大鼠流式检测Tfh细胞亚群减少,Tfr细胞亚群增加。3. Caspase-1抑制剂可以增加EAMG大鼠调节性B细胞数量结果显示caspase-1抑制剂治疗组大鼠B-Foxp3细胞数量较EAMG对照组增加,另外caspase-1抑制剂治疗组大鼠B-10细胞数量也较对照组增加,但是没有统计学差异。进一步检测了经R97-116抗原刺激细胞培养上清液中IL-10水平,结果显示caspase-1抑制剂治疗组大鼠IL-10水平较对照组增加。结论：1. Caspase-1抑制剂治疗可以降低EAMG大鼠抗R97-116 IgG抗体亲和性。2. Caspase-1抑制剂抑制生发中心反应。3. Caspase-1抑制剂减少滤泡辅助T细胞数量,增加滤泡辅助调节性T细胞和调节性B细胞数量。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R746.1

【相似文献】