SIRT3在实验性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-07-09 12:50

本文选题：SIRT3 + 蛛网膜下腔出血　；参考：《第二军医大学》2016年博士论文

【摘要】：研究目的动脉瘤性蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)作为临床上较为常见的一种脑血管危重症疾病,约占所有中风类型的5%。据报道,每年全球约有1/10000的人群罹患动脉瘤性SAH,其致残率和致死率高达50%。随着医疗器械和手术技术的不断更新,推动SAH的诊断和治疗领域取得显著进步,但迄今为止临床疗效仍难以令人满意,缺乏突破性进展。传统研究认为,迟发性脑血管痉挛(Delayed cerebral vasospasm,DCVS)应为动脉瘤性SAH后导致不良预后最为重要的原因,但抗痉挛治疗在临床上对改善病人预后却收效甚微。近年来早期脑损伤(Early brain injury,EBI)在动脉瘤性SAH后继发损伤中的重要作用逐渐得到研究学者的重视,一般将其定义为SAH后72小时内由多因素造成的脑组织的整体性损伤,目前研究认为EBI通过多途径影响预后,涉及包括氧化应激、炎症、凋亡在内的一系列病理生理改变,然而确切完整的机制尚不十分明确,亟待突破性的研究进展,以期为SAH患者提高生存率和改善预后提供最佳的治疗策略。沉默信息调节因子3(SIRT3)作为Sirtuin家族成员之一,进化过程中高度保守并依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),具有去乙酰化酶特性,在脑组织中有丰富的表达。作为一种调节能量平衡的关键性保护性因子,研究表明SIRT3蛋白通过调控线粒体内相关的乙酰化蛋白脱乙酰基水平参与线粒体蛋白的翻译后修饰调节,影响线粒体的能量代谢、底物氧化、炎症趋化和细胞凋亡等活动,成为机体多种疾病的病理发生发展过程中的重要作用机制之一,近两年来已成为氧化损伤、炎症及缺血性损伤研究的热点之一,在心脏、肝脏、肾脏的疾病研究中取得长足的进步,但在出血性脑卒中研究中还鲜有报道。结合既往研究成果提示SAH后早期自由基损伤、炎症反应激活机制在EBI病程发生发展中极为关键的作用,本研究我们合理推测SIRT3可能参与SAH后EBI形成过程,通过调控线粒体功能参与抗炎及自由基氧化损伤的保护性机制,发挥其起SAH后EBI的神经保护作用。研究方法本研究设计分三部分实施,第一部分首先采纳颈内动脉线栓刺破法建立实验性SAH的大鼠动物模型,并予以SIRT3激活剂白藜芦醇(Resveratrol)干预治疗,通过监测实验动物的神经功能评分、脑组织含水量、血脑屏障通透性以及皮层神经元凋亡情况以达到良好的模型动物质量控制和评估SIRT3激活后对EBI的保护效果;第二部分进一步通过荧光定量RT-PCR、Western blot及免疫组化观察实验性SAH后早期大脑皮层组织中SIRT3的转录翻译的表达情况,同时采用免疫荧光双标技术分别标记目标蛋白SIRT3和皮层细胞种属,进一步明确SIRT3的细胞特异性定位以及其在SAH后早期的种属特异性细胞中变化情况;第三部分通过筛选最佳诱导浓度的二氯化钴(Co Cl2)化学性损伤PC12细胞模拟SAH后的神经元损伤的体外环境,利用激动剂和抑制剂改变PC12细胞中SIRT3的表达水平,通过Western blot技术检测该损伤条件下,SIRT3表达水平对TLR4、PI3K/AKT以及Nrf2/ARE信号通路的影响,进一步探讨SIRT3对于SAH后EBI损伤保护的可能分子机制。1、在体实验部分:1)采用颈内动脉线栓穿刺法构建SD大鼠的实验性SAH动物模型;2)将实验大鼠分为对照组、假手术组、SAH组以及Resveratrol药物干预四组;3)采用Garcina神经功能评分、脑含水量、血脑屏障通透性、TUNEL细胞凋亡检测等方法评估模型动物的质量控制以及药物干预对EBI的保护效果。4)采用荧光定量RT-PCR、Western blot及免疫组化观察实验性SAH早期大脑皮层中SIRT3的转录及翻译水平的表达情况,采用免疫双标技术分别标记目标蛋白SIRT3和皮层细胞特异性种属,明确SIRT3的细胞特异性分布情况。2、离体实验部分:1)MTT法筛选二氯化钴(Co Cl2)诱导PC12细胞化学损伤的最佳浓度模拟SAH后的神经元损伤的体外环境;2)在最佳Co Cl2诱导损伤条件下,予以激动剂和抑制剂改变SIRT3表达水平,通过Western blot技术检测该损伤条件下,SIRT3表达变化对TLR4、PI3K/AKT以及Nrf2/ARE信号通路的影响。实验结果1、采用颈内动脉线栓刺破法成功建立实验性SAH的大鼠动物模型,质量控制满意;2、予以SIRT3激活剂Resveratrol干预后,对实验动物SAH建模后早期损伤有明确的保护作用;3、免疫组化显示SAH建模后早期大鼠大脑皮层组织SIRT3表达下降,进一步采用RT-PCR及Western blot证实SIRT3从转录到翻译水平的表达均明显下降;4、经免疫荧光双标技术鉴定SIRT3蛋白主要为神经元胞浆表达,在SAH建模后早期神经元胞浆中SIRT3蛋白表达下降,在胶质细胞中无明显变化;5、成功筛选Co Cl2诱导PC12细胞化学损伤的最佳浓度模拟建立SAH后的神经元损伤的体外环境;6、上调的SIRT3可能通过上调Nrf2/ARE通路中的Nrf2表达水平发挥其神经细胞的保护功能,其作用机制与TLR4以及PI3K/AKT信号通路关系并不密切。研究结论1、SIRT3激活对大鼠实验性SAH后早期脑损伤具有神经保护作用,能有效减轻脑水肿及血脑屏障破坏程度,改善神经功能评分。2、在实验性SAH早期大鼠的皮层脑组织中,SIRT3从转录到翻译的表达水平均呈下降趋势;3、SIRT3蛋白主要位于神经元的胞浆表达,在SAH后早期,神经元中的SIRT3蛋白胞浆表达下降,而胶质细胞中则无明显改变。4、SIRT3可能通过上调Nrf2/ARE通路中的Nrf2表达水平发挥其神经细胞的保护功能,其作用机制与TLR4以及PI3K/AKT信号通路关系并不密切。
[Abstract]:Objective To study the effect of SIRT3 in the diagnosis and treatment of SAH . The effects of SIRT3 on the expression of SIRT3 in the early cerebral cortex of SAH were investigated by means of Western blot and immunohistochemistry . 1 . The expression of SIRT3 protein in cerebral cortex of experimental SAH was decreased , and the expression level of SIRT3 was decreased in early stage of SAH .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.35

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