【摘要】：目的：本部分研究旨在通过携带RNA干扰(RNAi)的慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,探讨其对腺苷激酶(ADK)的干扰作用,为后续实验提供研究工具。方法：体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),携带ADK相关RNAi (P236)的慢病毒转染MSCs,根据GFP表达和细胞形态确定慢病毒转染的最佳感染复数(M0I),以对照病毒转染的MSCs作为对照,通过免疫荧光和western blot定性定量分析RNA干扰引起的MSCs中ADK含量的变化,并用ATP生物发光检测试剂盒分析腺苷含量变化。结果：全骨髓贴壁培养法获得的大鼠骨髓间充质干细胞形态标准且均一,呈长梭形,杂质细胞少,活性佳。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞的最适感染复数为30,感染效率为93.6±4.2%。 western blot显示：与对照组相比,RNAi (P236)可以使腺苷激酶的表达下降53%,免疫荧光检测进一步表明也RNAi可以下调腺苷激酶的表达。利用ATP生物发光检测试剂盒分析105个ADK下调的MSCs孵育8小时每毫升培养液增加13.8 ng腺苷。结论：RNA干扰(p236)可有效沉默大鼠骨髓间充质干细胞中腺苷激酶的表达,并使腺苷含量增加。目的：本研究探讨腺苷激酶的骨髓间充质干细胞移植在锂-匹罗卡品癫痫模型中的抗癫痫作用和神经保护作用。方法：慢病毒携带的绿色荧光蛋白基因标记MSCs,分别将ADK--MSCs和control-MSCs移植到成年SD大鼠双侧海马,移植一周后腹腔注射匹罗卡品制作癫痫模型,随机选取移植ADK--MSCs的大鼠中的一部分每天接受腺苷A1受体拮抗剂DPCPX注射并维持整个实验过程。其后分别于造模急性期(1天)、慢性期(30天)进行行为学(造模时癫痫发作情况、自发性癫痫发作频率监测)、电生理(EEG)以及免疫组织化学(冰冻切片尼氏染色,TUNEL染色)研究大鼠癫痫发作情况、脑电图变化和海马神经元变化。结果：匹罗卡品诱发了control-MSCs移植大鼠的癫痫持续状态和随后的自发性反复癫痫发作以及海马神经元凋亡和丢失。ADK基因沉默的MSCs移植减少了癫痫持续状态半小时内V级发作的总时间并减少了后期的自发性反复癫痫发作次数及癫痫波的频率；造模后一天,TUNEL染色示阳性细胞数减少、western blot示caspase-3活性降低,造模后30天尼氏染色示海马神经元丢失程度减少了33%。而接受DPCPX的ADK MSCs移植组没有这些改善。结论：腺苷激酶基因沉默的骨髓间充质干细胞移植可阻碍大鼠癫痫自发性发作的发生发展以及改善海马神经元损伤,而这种治疗作用是由于移植细胞释放的腺苷激活A1R。目的：评价匹罗卡品诱导的大鼠颞叶癫痫模型认知功能,研究ADK沉默的细胞移植对此癫痫大鼠认知功能的影响。方法：分别将ADK- -MSCs和control-MSCs移植到成年SD大鼠双侧海马,移植一周后腹腔注射匹罗卡品制作癫痫模型,随机选取移植ADK- -MSCs的大鼠中的一部分每天接受腺苷A1受体拮抗剂DPCPX注射并维持整个实验过程。其后于造模后4周进行水迷宫实验和新物辨认实验来评估ADK沉默的细胞移植对锂-匹罗卡品癫痫大鼠认知功能的影响。结果：在连续5天的水迷宫训练中,随着训练时间延长,正常大鼠寻找水下隐匿平台的策略逐渐完善,找到水下隐匿平台的时间(逃逸潜伏期)逐渐缩短,而癫痫大鼠表现出学习能力下降。与TLE-cont和SHAM组相比,ADK沉默MSCs移植组实验动物逃逸潜伏期明显缩短,能更快地找到逃生平台,学习能力更强,接近于未造模正常大鼠的水平;空间探索实验中,相比TLE-cont和SHAM组大鼠,ADK- -MSCs组大鼠穿梭平台的次数更多,然而AD K沉默MSCs移植后接受注射腺苷A1受体拮抗剂(DPCPX)组大鼠没有此变化。新物辨认实验中,相比未造模的正常大鼠,TLE大鼠对新物体探索的相对时间减少,而ADK-MSCs移植可改善这种减少,接受DPCPX后这种改善消失。对新物体探索的频率与对新物体探索的时间具有相似趋势,但没有达到统计学意义。结论：锂-匹罗卡品诱导的颞叶癫痫大鼠存在认知功能障碍；ADK沉默的骨髓间充质干细胞移植能有效改善锂-匹罗卡品癫痫大鼠的认知障碍,并通过腺苷A1受体发挥作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of adenosine kinase ( ADK ) on the expression of adenosine kinase in rat bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) by immunofluorescence and western blot . The results showed that RNA interference ( p236 ) could decrease the expression of adenosine kinase in rat bone marrow mesenchymal stem cells .
The effects of ADK - MSCs and control - MSCs on the cognitive function of epileptic rats were studied . The results showed that ADK - MSCs and control - MSCs were transplanted into adult SD rats .
ADK - silenced mesenchymal stem cell transplantation can effectively improve cognitive impairment in epileptic rats with lithium - pilocarpine and play a role in adenosine A1 receptor .
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1;R749.1
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本文编号：2118643
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