氧化石墨烯通过自噬介导的泛素化亨廷顿蛋白的清除作用及机制研究

发布时间：2018-07-17 05:24

【摘要】：大多神经退行性疾病是由于细胞内具有聚集倾向的病变蛋白的堆积造成的。真核细胞的蛋白代谢途径主要包括泛素蛋白酶体途径和自噬途径两种。而由于蛋白聚集体本身的尺寸较大,无法通过蛋白酶体的降解腔进行降解,自噬则成为其主要的降解途径。因此,通过提高自噬水平来加强对蛋白聚集体的降解能力是治疗神经退行性疾病的有效方案。之前有研究报道富勒烯纳米材料可以通过诱导细胞自噬提高及抗氧化作用缓解Aβ蛋白对细胞的毒害作用。碳纳米管也被报道可以恢复病变神经细胞的自噬能力。氧化石墨烯作为近年来被研究较多的碳基纳米材料因具有特殊的较好的生物相容性,丰富的表面基团,较大的表面积及独特的光热效应等优势被广泛用于生物学各个领域的研究。在本文中发现氧化石墨烯纳米材料可以有效促进亨廷顿细胞模型中病变亨廷顿(huntingtin)蛋白聚集体的清除。首先我们通过经典Hummers方法合成氧化石墨烯并通过原子力显微镜、紫外可见分析光谱、傅里叶红外光谱等对其理化性质进行了表征。细胞活力检测结果与报道一致,氧化石墨烯对细胞的毒副作用非常小。之后的实验中我们利用免疫印迹及荧光显微镜同时证明了氧化石墨烯所具有的促进病变亨廷顿(huntingtin)蛋白清除的现象并通过一系列实验发现,自噬上下游抑制剂及自噬相关基因的敲除都能抑制氧化石墨烯对病变亨廷顿(huntingtin)蛋白的清除作用而蛋白酶体的抑制剂却不能对其起到抑制效果,这证明氧化石墨烯的这一作用是自噬途径依赖的而非蛋白酶体途径依赖的。进一步地,我们更加全面、系统的检测了氧化石墨烯引发细胞自噬的能力,结果显示其可导致细胞内LC3-Ⅱ蛋白的转换,自噬体的形成等常见细胞自噬现象,却不能诱导p62的降解,这与相关报道一致,但游离GFP的释放及抑制自噬下游通路后自噬体的积累实验则证明氧化石墨烯引发的细胞自噬流是完整的。在自噬机理方面的研究中,首先我们证明了与之前报道的Becline一样,作为复合物中的另一分子PtdIns3K也在GO引发的自噬中起重要作用。其次实验结果显示,氧化石墨烯引发的细胞自噬是mTOR非依赖的。另外我们发现经氧化石墨烯处理后的细胞内ERK的磷酸化水平明显上升,并且ERK抑制剂可以抑制其引发的自噬效应。说明GO引发的细胞自噬是mTOR非依赖的及ERK依赖的。最后我们对氧化石墨烯清除病变亨廷顿(huntingtin)蛋白的机理进行了探讨。研究发现经氧化石墨烯处理后细胞内的泛素化水平明显升高,免疫共沉淀及体外结合实验表明,氧化石墨烯更倾向于结合泛素化的蛋白,同样相对于未泛素化的病变亨廷顿蛋白,也更倾向于结合其泛素化形式。结合透射显微镜结果所显示的细胞内大量包含材料的自噬泡的出现,我们得出结论,氧化石墨烯很可能直接与泛素化的病变亨廷顿蛋白结合后将其带至自噬体内并与溶酶体融合使蛋白聚集体进行降解。综上所述,我们的研究首次发现了氧化石墨烯在即清除病变蛋白聚集体方面的应用,并初步揭示了其机理,为纳米材料应用于神经退行性疾病的治疗相关方面研究提供了理论依据。
[Abstract]:It is found that graphene oxide nano - material can effectively promote the removal of huntingtin protein aggregates in Huntington ' s cell model .
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O613.71;R741

【参考文献】